基因工程第四章1.docVIP

第四章 基因克隆载体 1. 定义：携带外源基因进入受体细胞的这种工具称为载体（Vector）。 载体的本质是DNA。 2. 在基因工程中所用的载体，主要有5类： 质粒（Plasmid） 噬菌体(（( phage）的衍生物 柯斯质粒（Cosmid） 单链DNA噬菌体M 13 动物病毒 3. 理想的载体应具备的条件： 具有自我复制能力 有适宜的限制酶切位点，最好是对多种常用的限制酶有单一切点，并且这些单一切点在易于被检测的表型基因上 具有一个或几个选择性遗传标记 分子量较小，在受体细胞内有较多的拷贝数 可携带足够长度的外源DNA片断，并能有效的转化至宿主细胞中 容易从宿主细胞中分离纯化 4.1 质粒载体 4.1.1 质粒的一般生物学特性 1. 质粒：是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 它广泛存在于细菌细胞中，在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。 在基因工程中，多使用大肠杆菌质粒为载体。 质粒分子的大小为1~200kb，它可以“友好”地“借居”在宿主细胞中，依靠宿主细胞的现有体系进行自身复制，并将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达；同时质粒也提供给宿主细胞一些抗性、免疫性。 2. 质粒的类型 F质粒：又叫F因子或性质粒（sex plasmid），F+、F-。 F+(F-时，染色体标记低频转移，F因子高频转移 F质粒可以整合到染色体上，同步复制（这种菌株在与F-菌株杂交时，比F+所产生的遗传重组频率要高103倍），称为Hfr菌株（高频菌株） Hfr( F-时，染色体标记高频转移，F因子低频转移 F因子从染色体脱离下来时，往往会带有染色体片断，这种带有染色体片段的F因子称为F’因子。 R质粒：也称抗药性因子。 R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此中抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。 3. 质粒的分类 ( 根据质粒能否自己转移，可分为： 接合型质粒：自我转移的质粒，除含有自我复制基因外，还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因 非接合型质粒：不能自我转移的质粒，此类质粒能够自我复制，但不含转移基因组。从基因工程的安全角度讲，非接合型质粒用作克隆载体更为合适。 ( 根据质粒的拷贝数，可分为： 严紧型质粒：拷贝数1~3份 松弛型质粒：拷贝数10~60份 质粒的复制型不是绝对的，不仅受自身的制约，还同宿主的状况有关。 分子量大 分子量小 接合型质粒 拷贝数少 非接合型质粒 拷贝数多 严紧型复制 松弛型复制 4. 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这种现象称为质粒的不亲和性，也称不相容性。 彼此不相容的质粒属于同一个不亲合群；而彼此能够共存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。 不亲和群：来源于同一种原始质粒，利用相同复制系统的这类质粒。 4.1.2 几种常见的质粒 1. Col EI质粒载体 属于大肠杆菌Col类质粒中的一种，是一种天然质粒。大小为6.3 kb，分子量为4.2(106dal。含有EcoR I的单一酶切位点，具有松弛型复制子。 在培养基中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，宿主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止；而质粒DNA仍可继续进行数小时的复制，这样每个宿主细胞所累积的Col EI质粒的拷贝数可达1000~3000个。 Col EI质粒除了具有可以编码大肠杆菌素EI的基因外，还可以编码使宿主细胞对大肠杆菌素EI产生免疫性的基因。 对大肠杆菌素的免疫特征可作为一种选择标记。若在Col EI质粒的EcoR I位点插入外源DNA序列，则宿主细胞不能合成大肠杆菌素EI（Col EI -），而具有EI免疫性（Imm EI +）表型的为含有重组质粒的细胞。 2. pBR 322质粒载体 是人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体。大小为4.3 kb，分子量为4.2(106dal。具有Col EI松弛型复制子，拷贝数为60个/细胞。 pBR 322质粒上有两个选择性标记： ( 氨苄青霉素抗性基因（AmpR）：其上有Pst I的切割位点 ( 四环素抗性基因（TetR）：其上有BamH I、Hind III、Sal I的切割位点 对pBR 322质粒可利用插入失活法进行重组体的选择。例如用BamH I切割后插入外源DNA片段，形成AmpR、TetS，在如下的抗菌素培养平板上进行检验，即可方便的筛选出重组体DNA（红色菌落）。 pBR