[WesternBlot蛋白质双向电泳]解析.pptVIP

（1）样品制备： 为什么要进行样品制备？ 蛋白质双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点。 待研究样本常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。 （2）IPG条重泡涨及上样：取大约30-60 μg的蛋白与溶胀液混合，总体积为250 μL。 （4）IPG 胶条的平衡 平衡缓冲液Ⅰ 含DTT 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态 平衡缓冲液Ⅱ 含碘乙酰胺 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化 硝酸银染色 优点：灵敏度高， 缺点：重复性差，质谱兼容性低 考马斯亮兰染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低 荧光染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵 其它染色方法： 胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等 （7）成像及图像分析 典型流程 凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立 注意事项 （1）根据预分离蛋白质的相对分子质量范围确定使用的凝胶的浓度。 （2）凝胶染色方法众多，其主要区别是灵敏度不同，需根据实际需要选择。通常考马斯亮蓝染色能检测到约含量为1 μg的蛋白质点，硝酸银染色法能检测到含量为ng级的蛋白质点。 （3）离子是等电聚焦过程