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第10章 吸光光度法 10.1 概述 10.2 吸光光度法基本原理 10.3 分光光度计 10.4 显色反应及影响因素 10.5 光度分析法的设计 10.6 吸光光度法的误差 10.7 常用的吸光光度法 10.8 吸光光度法的应用 10.1 概述 吸收光谱 发射光谱 散射光谱 10.2 吸光光度法基本原理 1 吸收光谱产生的原因 光:一种电磁波,波粒二象性 吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小 A～l关系 最大吸收波长 lmax：光吸收最大处的波长 4 朗伯-比尔定律 灵敏度表示方法 摩尔吸光系数 e 吸光度的加和性 1 分光光度计的组成 常用光源 单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅 检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列 要求： a. 选择性好 b. 灵敏度高 (ε104) c. 产物的化学组成稳定 d. 化学性质稳定 e. 反应和产物有明显的颜色差别 (?l60nm) （一） 显色剂用量 M（待测组分）+R（显色剂）? MR（有色络合物） 4. 干扰的消除： 1）加入络合掩蔽剂或氧化还原剂，使干扰离子生成无色络合物或离子； 2）选择适当的显色剂以避免干扰； 3）分离干扰离子； 4）选择适当的光度测量条件，消除干扰离子的影响。 吸光度A的大小与测量误差的关系： 用数学方法推导出TE最小的吸光度读数。 则总吸光度为： 减少由非单色光引起的偏离朗伯－比耳定律的方法 ： 高吸光度法：光电检测器未受光时，其透光度为零，光通过一个比试样溶液稍稀的参比溶液后照到光电检测器上，调其透光度（T）为100％，然后测定试样溶液的吸光度。此法适用于高含量测定。 ?低吸光度法：先用空白溶液调透光度为100％，然后用一个比试样溶液稍浓的参比溶液，调节透光度为零，再测定试样溶液的吸光度。此法适用于痕量物质的测定。 ? 双参比法：选择两个组分相同而浓度不同的溶液作参比溶液（试样溶液浓度应介于两溶液浓度之间），调节仪器，使浓度较大的参比溶液的透光度为零，而浓度较小的参比溶液的透光度为100％，然后测定试样溶液的吸光度。? 导数光谱的测量有多种方法：?（1）如果基线是平坦的，可以测量峰-谷之间的距离，这是最常用的方法。?（2）在基线平坦的情况下，也可以测量峰-基线之间的距离，这时灵敏度虽有些降低，但精度较高。?（3）作两峰的连接线，测量两峰连线到谷的距离。只要基线是直线，不管它是否倾斜，总能得到正确的值。? （4）作峰顶与谷顶的切线，使其平行于基线，然后测量两平行线的距离。?关于导数吸光光度法提高灵敏度的规律，有人指出n阶（n＝1～4）导数吸光光度法的灵敏度是按4.5n倍增大 （三）显色温度、时间、溶剂及干扰的消除 显色温度：一般在室温下进行（实验确定） 2. 显色时间：通过实验，作出吸光度-时间曲线，求出适宜的显色时间。 3.溶剂的影响 有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度，如在Fe(SCN)3中加入丙酮颜色加深。还可能提高显色反应的速度，影响有色络合物的溶解度和组成等。 10.5 光度分析法的设计 1. 选择显色反应 2. 选择显色剂 3. 优化显色反应条件 4. 选择检测波长 5. 选择合适的浓度 6. 选择参比溶液 7. 建立标准曲线 测量条件选择 1 测定波长选择 选择原则：“吸收最大，干扰最小” 灵敏度 选择性 2 测定浓度控制 控制浓度 吸光度A：0.2～0.8 减少测量误差 对于分光光度计，我们知道透光率的标尺是均匀的，而吸光度A的标尺是不均匀的。 根据朗伯－比耳定律： ∵ ∴ 或 由此可见：误差最小时所对应的T=0.368; A=0.434。 一般来说：当T为0.15～0.65 或 A为0.2～0.8时可作为光度分析的适宜读数范围。 3 参比溶液选择 仪器调零 消除吸收池壁和溶液对入射光的反射 扣除干扰 参比溶液是用来调节仪器的吸光度读数为零，以消除比色皿厚度不均匀和溶剂对入射光的反射与吸收而带来的测量误差。 参比溶液的选择原则是： ① 当试液和显色剂均无色时，用蒸馏水作参比。 ② 若试液有色而显色剂无色，用试液作参比。 ③ 若显色剂有色而试液无色，用显色剂作参比。 ④ 若显色剂和试液均有色，则取一份试液先加适当的 掩蔽剂将待测组分掩蔽后，再加显色剂和其它试剂， 以此作参比。 4 标准曲线制作 理论基础