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第四章 细菌的生化试验 微生物生化反应：指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 微生物检验中常用的生化反应有： 糖或醇类发酵试验 淀粉水解试验 V-P试验甲基红（MR）试验 靛基质（Indole）试验 过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验 明胶液化试验 尿素酶（Urease）试验 氧化酶试验 硫化氢（H2S）试验 三糖铁（TSI）琼脂试验氨基酸脱羧酶的测定 耐盐性试验 卵磷脂酶的测定石蕊牛奶反应 酪蛋白水解 苯丙氨酸脱氨试验氰化钾试验 对叠氮化钠的抗性 硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验含碳化合物的利用（柠檬酸盐或丙酸盐利用） 第一节 细菌的生化试验 一、概述 （一）、什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。 （二） 检验细菌的生化试验范围 1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验 3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验 （三）生化试验的方法 在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。 （四）生化试验的注意事项 1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。 二、糖醇类代谢试验 （一） 糖醇类发酵试验 1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇），有的只能分解1~2种糖醇 ，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。 常用的糖醇 单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇 2、试验方法： 用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃ 培养1~3天，每天观察结果。 3、结果观察和记录 记录： 产酸不产气，阳性，以“+”表示 产酸产气，阳性，以“⊕”表示 不产酸产气，阴性，以“-”表示 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 　1、原理： 细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。　 2、方法 取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4h天，每天观察结果。 3、结果观察与记录 （三） V-P试验 1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。 2、试验方法　　 （１）奥梅拉法： 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 ℃培养48h， 每1ml培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml，摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h ，或在48~50 ℃水浴放置2h后判定结果。 （2）贝立脱法： 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃培养2天，每2ml培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1 ℃培养 4h ，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。 （3）快速法： 将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。 3、结果观察与记录 （1）发酵管出现红色者，为阳性， 记V-P + （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P - （四）甲基红试验（MR） 1、原理　细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，