杨荣武生物化学原理第四章蛋白质的性质分类及研究方法分析报告.ppt

* 第四章 蛋白质的性质及研究方法 肌红蛋白晶体 * 第一节 蛋白质的理化性质 紫外吸收：最大吸收峰为280nm 两性解离：蛋白质的pI值不能直接计算，只能使用等电聚焦等方法进行测定 胶体性质 沉淀反应：盐析、pI 沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀 变性、复性 水解 颜色反应 * 蛋白质变性 蛋白质受到某些理化因素的作用，其高级结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象。 导致蛋白质变性的物理因素有：加热、冷却、机械作用、流体压力和辐射；化学因素有强酸、强碱、高浓度盐、尿素、重金属盐、疏水分子和有机溶剂。 蛋白质变性以后，其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。主要的变化包括：（1）溶解度降低。（2）粘度增加。（3）生物活性丧失。（4）更容易被水解。（5）结晶行为发生变化。 * 蛋白质的水解 蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均能够发生水解。但需要注意的是，酸水解会破坏几种氨基酸，特别是Trp几乎全部被破坏，其次是三种羟基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性条件下，容易水解成Glu和Asp。酸水解常用硫酸或盐酸，使用最广泛的是盐酸；碱水解会导致多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，但不会破坏Trp；酶水解效率高、不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但由于不同的蛋白酶对肽键特异性不一样，因此，由一种酶水解获得的通常是蛋白质的部分水解产物。 * 四种羧肽酶来源和特异性 * 几种蛋白酶特异性的比较 * 反应名称 反应试剂 颜色 用处 双缩脲反应 硫酸铜，碱性溶液 紫红色（540nm） 定量测定蛋白质 黄色反应 硝酸 先产生白色沉淀，加热变黄，再加碱呈橙黄色 鉴定含有芳香族氨基酸的蛋白质 米伦氏反应 硝酸、硝酸汞、亚硝酸、亚硝酸汞混和液 先是白色沉淀，加热后变成红色 鉴定含有Tyr残基的蛋白质 乙醛酸反应 乙醛酸、浓硫酸 紫色环 鉴定含有Trp残基的蛋白质 坂口反应 次氯酸钠、α-萘酚、氢氧化钠 红色 鉴定含有Arg的蛋白质 福林反应 磷钼酸、磷钨酸 蓝色 Lowry法鉴定含有Tyr残基的蛋白质 醋酸铅反应 醋酸铅 黑色 含有Cys的蛋白质 考马斯亮蓝结合反应 考马斯亮蓝G-250酸性溶液 蓝色 Bradford法定量测定蛋白质 蛋白质的各种颜色反应 * 蛋白质研究方法 假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X 1. 如何得到这种蛋白质? 蛋白质的分离、纯化技术 2. 这种蛋白质的大小？ （SDS） 3.它的pI是多少？ （等电聚焦） 4. 其他细胞或其他生物体内是否存在？ （Western印迹） 5. 其一级结构如何？ （序列分析） 6.其三维结构又如何？ X-射线衍射和核磁共振 * 蛋白质纯化 一、准备工作 要解决三个问题： （1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。 二、纯化步骤： （1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）； （3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）； （5）鉴定 * * 等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI * 蛋白质的双向电泳 * Western印迹 * 第二节 蛋白质一级结构的测定 直接测定法 间接测定法。 先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。 * 测定步骤 主要试剂和方法 备注 1 详见蛋白质的纯化 2 极端pH；8mol/L 尿素； 6mol/L 盐酸胍；高盐 (常用硫酸氨)。 如果肽链之间以二硫键相连，可使用步骤3的方法进行拆分。 3 过甲酸氧化法； 巯基类还原剂还原法：巯基乙醇；二硫苏糖醇（DTT）或二硫赤藓糖醇。 第二种方法需要使用烷基化试剂，如碘代乙酸，防止二硫键从新形成。 4 氨基酸自动分析仪 为步骤6和7选择合适的裂解法提供有用的信息。 5 N-端测定：Sanger试剂法；丹磺酰氯法；PTIC或其衍生物测定法。 C-端测定：肼解法；还原法：使用硼氢化纳将C-端氨基酸残基转变成氨基醇，而将它与其它氨基酸区别开来。羧肽酶法（羧肽酶A、B，参考表4-2） 如果N-端氨基被封闭，不能直接使用表中的方法，需要根据可能的封闭类型，区别对待。如果氨基是被甲酰或乙酰化封闭的，需要先将甲酰基或乙酰基水解。如果氨基是被焦谷氨酰化封闭的，可以使用专门水解焦谷氨酸残基的焦谷氨酸氨肽酶，直接进行分析。 6 酶解法；化学裂解法（BrCN） 7 同上 8 蛋白质序列自动分析仪；质谱法 片段重叠