基因工程实验指邢万金 扈廷茂 编写内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室.docVIP

基因工程实验指导 邢万金 扈廷茂 编写 2005年6月（第二次修订） 内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室 目 录 基因工程实验注意事项———————————————————————————（2） 实验流程参考图——————————————————————————————（3） 第一部分 质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定 实验一 质粒DNA的小量制备———————————————————————（4） 实验二 质粒DNA电泳鉴定————————————————————————（6） 实验三 质粒DNA的酶切—————————————————————————（8） 第二部分 目的基因的获得和重组载体的构建 实验四 PCR扩增制备目的基因———————————————————————（10） 实验五 目的基因片段与载体连接——————————————————————（12） 实验六 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断———————————————————（14） 第三部分 感受肽细胞的制备和转化及筛选鉴定 实验七 感受态菌的制备——————————————————————————（16） 实验八 细菌转化—————————————————————————————（18） 实验九 转化克隆的筛选和鉴定———————————————————————（20） 第四部分 目的基因在原核细胞中表达与SDS鉴定 实验十 外源基因的诱导表达————————————————————————（22） 实验十一 SDS检测表达蛋白—————————————————————（24） 附 录 附录1：表达载体pET-His的相关资料————————————————————（27） 附录2：从NIH查阅的nattokinase（纳豆激酶）序列之一————————————（28） 附录3：本实验所用的克隆载体图——————————————————————（29） 基因工程实验注意事项 上实验课的学生每两人分为一个小组。 课前要提前预习实验内容，弄懂实验设计的原理，理清实验顺序。认真填写《本科基因工程实验论文开题报告》，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。 实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。各小组学生应根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。 本实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在10天之内完成。 实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！ 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。 写作实验报告和实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻（包括操作的错误）。 在实验室内不能大声喧哗。 10．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。 11．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。 值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。 13．实验时损坏的任何物品都要及时申报。 实验流程参考图 第一部分 质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定 实验一 质粒DNA的小量制备 1．目的 学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。 2．原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0(12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。 3．器材 超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。 4．试剂 pET-his质粒载体菌,pMD18-T-NK载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。 5．实验准备 氨苄青霉素储存液