实验八质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测教案解析.ppt

T-载体 * * * * * 实验八 质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测 实验学时：6 学时 实验类型：综合性 每组人数： 4 人／组 一、实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法。 1.碱裂解法小量制备质粒DNA 实验背景 质粒是染色体外的DNA分子，大小在1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在，它是细菌内的共生型遗传因子。 质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 20～200个拷贝 /细胞 严紧型质粒 1～2个拷贝 /细胞 质粒性质 二、实验原理 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0 ~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、仪器、材料与试剂 (一)仪器 1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．台式离心机 4．高压灭菌锅 (二)材料 1．含连接外源基因质 粒的E. coli 2．1.5mL Eppendorf管 3．吸头、微量移液器 Solution I 50mmol／L 葡萄糖 25mmol／L Tris·HCl(pH8.0) 10 mmol／L EDTA (三)主要试剂 Solution II 0.4mol／LNaOH，2％SDS, 用前等体积混合 Solution III 5mol／L 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11．5mL 水 28．5mL TE缓冲液 10mmo1／L Tris·HCl 1mmo1／L EDTA(pH8.0) 胰RNA酶溶液 将RNA酶溶于10mmo1/L Tris·HCl(pH7．5)和15mmo1/L NaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。 １．挑取琼脂培养板上的单菌落至5 ml LB培养液中（含Amp 50μg/ml）， 37℃强烈振荡培养过夜。 ２．取1.4 ml培养液至Eppendorf管中，12000rpm离心30秒，弃上清，取沉淀。 ３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀。 ４．加入200μl溶液Ⅱ，缓慢颠倒离心管，混匀（勿剧烈震荡），将离心管置于冰上2 min。 四.实验步骤 ５．加入150μl溶液Ⅲ，颠倒混匀数次,使粘稠的细菌裂解物分散均匀,冰上放置5 min。 ６．12000 rpm 4 ℃离心5 min，取上清移到１个新的Eppendorf管中。 ７．加入等体积氯仿：异戊醇（24:１）振荡混匀, 12000rpm 4 ℃离心8 min。取上清移至另１个Eppendorf管中。 ８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于-20℃静置1 hr(或-80 ℃ 静置15 min）。 ９．12000 rpm , 离心10 min，弃上清。 10．加入0.5ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒 数次，12000 rpm于离心5 min。 11．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5~15 min）。 12．加入20 μl无菌水（含RNA酶）溶解DNA。 所提DNA需保存于冰箱（-20℃），用于后续实验。 1.超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA); 2.开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA); 3.线形质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 两条链发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。 质粒3种构型 一、实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 二、实验原理 DNA分子在