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* Ch5 酶固定化技术及固定化酶反应器 固定化酶于20世纪，50年代开始研究，到70年代产业化应用的一项酶工程新技术；酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制在一定区域内，但仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。因此，酶固定化技术是将酶蛋白固定在一定的载体上的方法; 酶固定化技术主要解决以下几个方面的问题: ① 增加酶稳定性。 ② 改善酶制剂的应用工艺。 ③ 使酶蛋白得到重复使用。 ④ 便于使酶蛋白与催化产物分离。 固定化酶的制备原则： ⑴ 固定化处理后不能改变酶的专一性 及其它催化特性； ⑵ 固定化载体应有一定的刚性，有利于固定化酶的应用工艺自动化； ⑶ 固定化处理应有尽可能小的空间位阻，不影响酶活性中心的临近 和定向效应； ⑷ 酶与载体的结合要牢固，一般不受应用环境条件的影响； ⑸ 固定化处理后，酶活性的稳定性要有明显改善； ⑹ 固定化酶制剂的生产成本要低。 Ch5－1 酶固定化方法 / 技术 按固定化反应类型分, 酶固定化方法分以下四种 吸附法 共价法 交联法 包脉法 近年来人们将吸附法和交联法结合起来，建立了吸附－交联法 Ch5－1 酶固定化方法 / 技术 1 吸附法固定化技术 此法是酶固定化研究最早的方法, 以吸附剂作载体, 利用物理吸附的原理,对酶蛋白进行固定化的一种方法。 此法的优点是: 固定化酶的制备简单; 酶固定化载体的再生方便; 缺点: 酶与载体的结合不牢固, 在固定化酶的应用过程中, 受到介质的 pH、离子强度、反应温度等因素的影响。 常用的固定化载体: 高岭土、磷酸钙凝胶、多孔玻璃、羟基磷灰石; DEAE-SephadexA50, SephadexA25, DEAE-纤维素等。 Ch5－1 酶固定化方法/技术 2 交联法固定化技术 交联法 交联法是利用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与载体之间发生交联反应, 制成具有网状结构的固定化酶的方法。 常用的双功能试剂有: 戊二醛： [OHC－(CH2)3－CHO] 最常用的是戊二醛, 戊二醛有; 两个醛基, 这两个全集醛基都可以与酶蛋白分子上的游离氨基发生反应,戊二醛本身起到分子间桥作用。 反应式如: OHC－(CH2)3－CHO＋n[E]= －CH=N－E－Ｎ＝CH－－－ 己二胺： 顺丁烯二酸酐等; 利用戊二醛作交联剂进行酶固定化具有以下特点: A 戊二醛与蛋白质的反应迅述, 一般在1小时内即克完成反应。 B 反应受基质的离子强度有关, 反应的pH范围较广, 能在pH5-9进行。 C 交联反应, 是不可逆的。酶固定化载体的再生比较困难。 D 在利用戊二醛进行交联反应时, 不仅有分子间交联反应, 而且同时发生分子内交联反应, 在酶固定化后, 对酶分子的稳定性有较大的改善, 但由于发生供价反应, 在固定化后有部分酶蛋白失活。 E 从交联反应原理不难理解, 戊二醛的醛基与酶蛋白的游离氨基发生反应, 因此, 对于大部分载体来说, 在固定化反应时, 反应体系中, 主要是酶分子内或分子间的交联反应, 酶蛋白与载体之间的反应较少；所以目前用的最多的是吸附交联反应, 即将吸附和交联反应结合起来, 首先将酶蛋白吸附到载体上, 然后再加入交联剂戊二醛, 使酶蛋白分子形成网格结构, 牢固地附着在载体上。 F 以戊二醛为交联剂时，所用的载体主要是那些带有表面游离氨基的颗粒物质；常用的有聚苯乙烯、尼龙、多孔玻璃。 Ch5－1 酶固定化方法/技术 3 吸附－交联法固定化技术 吸附－交联法是将吸附法和交联法结合起来，建立的一种良好方法，两种方法的结合，在一定程度上克服了2种方法的不足。 ① 吸附法酶与载体结合不牢固； ② 交联法酶与载体交联效率低； ③ 交联法载体局限性； Ch5－1 酶固定化方法/技术 3 吸附－交联法固定化技术 吸附交联法固定化酶蛋白的基本操作过程: A 吸附条件测定:主要包括 基质的离子强度、pH、酶蛋白与载体的最佳比例、吸附完成时间。 B 吸附： 在测定吸附条件后, 进行酶蛋白的吸附, 在进行吸附时, 要进行不断的搅拌, 但搅拌的述度不能太快, 太快反而不利于吸附进行。 C 加交联剂: 交联剂的用量因不同的酶蛋白而不同, 交联剂加入量不够, 交联反应进行不完善, 酶固定化反应不牢固, 交联剂加入过多, 过渡的分子内交联反应, 影响酶活收率；交联反应时间一般1小