基因结构与功能分析资料.ppt

第二节 基因表达产物分析技术 一、通过检测RNA而在转录水平分析基因表达 根据分析方法的原理和功能特性，可将基因转录水平分析分为封闭和开放性系统研究方法。 封闭性系统研究方法（如DNA芯片、RNA印迹、实时RT-PCR等）的应用范围仅限于已知基因。开放性系统研究方法（如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等）可用于发现和分析未知基因。 （一）用核酸杂交法检测RNA表达水平 1. 用RNA印迹分析RNA表达 RNA印迹被广泛应用于RNA表达分析，并作为鉴定RNA转录本、分析其大小的标准方法。 2. 用核糖核酸酶保护实验分析RNA水平及其剪接情况 RNA酶保护实验（ribonuclease protection assay，RPA）是一种基于杂交原理分析RNA的方法，既可进行定量分析，又可研究其结构特征。 3. 用原位杂交进行RNA区域定位 原位杂交（ISH）是通过设计与目标RNA碱基序列互补的寡核苷酸探针，利用杂交原理在组织原位检测RNA的技术，其可对细胞或组织中原位表达的RNA进行区域定位，同时也可作为定量分析的补充。 （二）用PCR技术检测RNA表达水平 1. 用逆转录PCR进行RNA的半定量分析 逆转录PCR（RT-PCR）一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。 2. 用实时定量PCR进行RNA的定量分析 实时定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。 （三）用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平 1. 基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于对不同状态下的基因表达谱进行比较，揭示转录组差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。 2. 用循环芯片测序技术分析基因表达谱 运用循环芯片测序技术，可对基因表达谱进行高通量分析，一次可完成几十万到几百万个DNA分子片段的序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌。 二、通过检测蛋白质/多肽而在翻译水平分析基因表达 （一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽 （二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽 酶联免疫吸附实验（ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质/多肽分析方法，其主要用于测定可溶性抗原或抗体， （三）用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达的蛋白质/多肽 免疫组化实验包括免疫组织化学和免疫细胞化学实验，二者原理相同，都是用标记的抗体在组织/细胞原位对目标抗原（目标蛋白质/多肽）进行定性、定量、定位检测。 （四）用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞 流式细胞术（flow cytometry）通常利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经流式细胞仪分析荧光信号，根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞做出判断。 （五）用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质/多肽表达水平 1. 用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱 根据制作方法和用途不同，可将其分为蛋白质检测和功能芯片两大类。蛋白质检测芯片包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片等，它是将具有高亲和力的特异性探针分子固定在基片上，用以识别生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质∕蛋白质-DNA∕蛋白质-RNA，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、蛋白质-小分子等的相互作用。 蛋白质芯片可用于检测组织∕细胞来源的样品中蛋白质的表达谱；其精确程度、信息范畴取决于芯片上已知多肽的信息多寡。 2. 用双向电泳分析蛋白质/多肽表达谱 双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质，对差异表达的蛋白质进行鉴定。 第三节 基因的生物学功能鉴定技术 一、用功能获得策略鉴定基因功能 基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。 方法： 转基因技术 基因敲入技术 （一）用转基因技术获得基因功能 转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞（embryonic stem cell），即ES细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。 转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。转基因小鼠最为常见。 （二