蛋白质生化资料.ppt

大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。 蛋白质量浓度（mg/ml）=1.45 A280nm-0.47 A260nm 紫外吸收法 蛋白质的分离和分析技术 蛋白质的一级结构研究 蛋白质测序 1、测定蛋白质的一级结构的要求 样品必需纯（97%以上）； 知道蛋白质的分子量； 知道蛋白质由几个亚基组成； 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 蛋白质的纯化 蛋白质的一级结构研究 粗分级 选择性沉淀(中性盐,有机溶剂,等电点沉淀等) 细分级 离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、电泳分离、色谱技术等 最后达到结晶状态，蛋白质结晶不仅是纯度的一个标志，也是判定制品处于天然状态的有力指标 蛋白质的分离和分析技术 蛋白质的纯化 蛋白质的一级结构研究 1、根据溶解度不同的分离 盐析：蛋白质溶液中离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降，离子强度足够高时，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来。优点：保持蛋白质的天然构象，能再溶解。常用试剂：(NH4)2SO4，MgSO4，MgCl2 有机溶剂沉淀：一些与水互溶的有机溶剂，甲醇、乙醇、丙酮等使蛋白质在水溶液中的溶解度显著降低。 蛋白质的分离和分析技术 蛋白质的纯化 蛋白质的一级结构研究 2、根据分子量大小的分离 透析与超滤(Pr相对分子质量＞5000) 密度梯度离心：蛋白质分子在具有密度梯度的介质中离心时质量和密度大的分子沉降快，且沉降到与自身密度相等的介质梯度时停止不动。（CsCl、蔗糖） 凝胶过滤 蛋白质的分离和分析技术 蛋白质的纯化 蛋白质的一级结构研究 3、根据电荷不同的分离 电泳：外电场作用下，带点颗粒向着其电性相反的电极移动。其移动速度取决于所带电荷量、颗粒大小和形状。 离子交换层析：阴阳离子交换树脂，如阳离子树脂含有强酸性基团-SO3H，可解离出H+，溶液中含有其它阳离子时可以和H+发生交换而结合到树脂上。阴离子树脂-N(CH3)OH 蛋白质的分离和分析技术 蛋白质的纯化 蛋白质的一级结构研究 4、根据对配基的生物学特异性的分离 亲和层析：基于某种蛋白的生物学特异性，与配基特异性的结合，而非共价结合。所谓的配基指能被特定生物大分子所识别并与之结合的原子、原子团和分子。如酶和底物，激素和受体，抗原和抗体等。 推荐阅读《蛋白质技术手册》汪家政主编，北京：科学出版社，2000 蛋白质的分离和分析技术 如果要在溶液中把一种DNA结合蛋白（X）和其他三种蛋白分开（A、B和C），蛋白有如下的性质: 蛋白质 pI 相对分子量 结合DNA A B C X 7.4 3.8 7.9 7.8 82 21.5 23 22 是 是 否 是 问：1、如何分开蛋白X和蛋白A？ 2、如何分开蛋白X和蛋白B？ 3、如何分开蛋白X和蛋白C？ 2、测定步骤 (1)、多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 蛋白质的分离和分析技术 2、测定步骤 (2)、测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 一个寡聚蛋白（MW＝72000）是由相同亚基组成的，该蛋白可以完全解离并与2,4-二硝基氟苯反应。由100mg该蛋白可以获得5.56μM的DNP-Gly，该蛋白含有几个亚基？ 蛋白质的分离和分析技术 2、测定步骤 (3)、二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。 蛋白质的分离和分析技术 2、测定步骤 (4)、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比； 蛋白质的分离和分析技术 2、测定步骤 (5)、分析多肽链的N-末端和C-末端。 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 二硝基氟苯（DNFB）法 丹磺酰氯法 肼解法(C-端) 蛋白质的分离和分析技术 肼解法 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余