聚合酶链反应.资料.pptVIP

* 选取适当的组织，提取总RNA 以mRNA做模版 加入引物、逆转录酶、dNTP、 合成cDNA的第一链 逆转录酶水解mRNA链 合成cDNA的第二链 加入引物、Taq酶，做常规PCR 扩增出大量的cDNA分子 * RT-PCR操作需注意的问题： 1.模版RNA应严格纯化，； 2.避免RNA酶污染； 3.所用与实验有关的物品，需用0.1％的 焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡处理。 * 增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产物亦少。约经15～20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。 * 2. 巢式PCR（nest PCR） 　此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 　　　除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。 * 巢式PCR 采用两对引物进行P