核酸的化学资料.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 。 * * * * * * * * DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 Tm：DNA热变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度(melting temperature, Tm)。 DNA的变性温度 Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。 2、复性 DNA复性(renaturation)的定义 变性DNA在适当条件下，可使两条彼此分开的链重新由氢键连接而形成双螺旋结构，这一过程称为复性。 减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 ——热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 3、核酸的杂交 加 温 缓慢 降温 加 温 缓慢 降温 （ 变 性 ） （ 复 性 ） （ 分 子 杂 交 ） DNA-RNA杂交示意图 利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。 常用的核酸分子杂交技术有：原位杂交、斑点杂交、Southern杂交及Northern杂交等。 第三节 核酸的分离与含量测定 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）； ②排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 。 ③无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应去除RNA分子）。 一、核酸的提取、分离和纯化 分离核酸 应注意以下几点： ①减少化学因素对核酸的降解， ②减少物理因素对核酸的降解： ③防止核酸的生物降解： 进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 核酸提取的主要步骤： 一般为破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。 RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径： 1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来； 2)直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相 关键的是抑制ＲＮＡ酶活性 RNA抽提、纯度分析及鉴定RNA的完整性 TRIZOL 法提取RNA TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。 先加入TRIZOL试剂，吹散；加入氯仿剧烈振摇，离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。离心，吸取水相。 异丙醇沉淀还原水样层中的RNA。离心，移去上清液。 沉淀中加75%乙醇洗涤，离心，去上清。 室温下挥干，加无RNA酶的水溶解，-70℃保存。 (2) 紫外吸收测定法分析RNA浓度、纯度 用无RNA酶的水稀释RNA，读取其在分光光度计260 nm和280 nm处的吸收值。计算样品RNA浓度。RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。 28S 18S LPS Con (3) 琼脂糖凝胶电泳观察 上述RNA溶液经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，要求显示较为清晰的28S及18S两条RNA带。 （一）定磷法 RNA平均含磷量为9.4%， DNA平均含磷量为9.9%，可根据样品的含磷量计算RNA或DNA的含量。 二、核酸含量测定的原理 （二）定糖法 核糖的测定 脱氧核糖的测定 （三）紫外吸收法 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * * * * * * * * * * * * * 1、结构要点： （1）由逆向平行的两条脱氧多核苷酸链组成双螺旋。 （2）两链之间遵循特定的碱基互补规律（碱基配对）。 A — T G —