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第五章 酶与细胞的固定化技术 酶的固定化 细胞及细胞器的固定化 固定化酶（细胞）的评价指标 第一节 酶的固定化 固定化酶是指借助于物理或化学方法，将酶固定在载体上，并在一定的空间内进行催化反应的酶。 固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体。 固定化酶的特点 稳定性提高，使用寿命延长 可得到高纯度、高产量的产品 可以连续化生产操作 反应的最优化控制成为可能 再生产利用 缺点 酶活力有一定损失，初始的投资大。 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜。 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定。 一、酶的固定化方法 1．物理吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。 载体类别： 天然无机载体 ：活性炭，硅藻土，硅胶等。 有机载体：淀粉，纤维素，谷胶原等。 2、包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。分为： （1）网格型 （2）微囊型 （1）网格型 将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。 载体材料： 合成高分子化合物：聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，光敏树脂 天然高分子多糖类：淀粉，明胶，海藻酸，角叉菜胶。 聚丙烯酰胺包埋制备固定化酶的过程：将酶溶液加入到含有丙烯酰胺（单体）和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（交联剂）的溶液中，再加入二甲氨基丙腈（加速剂），同时加入过硫酸钾（引发剂）混合，于25℃保温10min，即得含酶凝胶，将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒，于低温储存或冷冻干燥。 （2）微囊型 将酶或微生物菌体包埋在高分子半透膜中的微囊内称为微囊型包埋法。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 ① 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜从而将酶包埋。 ② 界面聚合法 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。 ③ 二级乳化法 酶溶液先在高聚物（乙基纤维素、聚苯乙烯等）有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物固定化后，每个固体球内包含多滴酶液。 ④ 脂质体包埋法 采用双层脂质体形成的极细球粒包埋酶。 3、结合法 通过选择适宜的载体，通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 离子键结合法 共价键结合法 离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度 优缺点： 操作简便，条件温和，酶活力回收率高；易受缓冲液种类和pH影响，易脱离。 共价键结合法 通过共价键将酶蛋白的侧链基团与载体的官能团结合的固定化方法。 可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 (非活性中心基团) 常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体 优缺点：操作复杂，酶结构性质变化，回收率低，不适用于微生物细胞固定；不易脱落。 载体活化的方法 重氮法 叠氮法 烷基化反应法 硅烷化法 溴化氰法 ① 重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8∽9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等 该方法需要载体具有芳香族氨基 ② 叠氮法 对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。 ③溴化氰法 主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。 ④ 烷基化反应法 含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。 4、交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 交联法常用试剂 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)。 双重固定法 吸附交联法 交联包埋法 5、热处理法 将酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。 只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，热处理也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。 复