RealtimePCR的原理和应用-release资料.ppt

Real time PCR的问题及解决方案 Realtime PCR的重现性很差怎么办？ PCR 反应扩增的效率，如果在反应体系中扩增效率不一致，就会影响到目的基因在单位时间内的产量发生差异，从而影响到结果的稳定，要解决这个问题，必须尽量优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。 目的基因的初始浓度，初始拷贝数越低，结果的重复性越差，为了保证获得精确的结果，应使用初始浓度具有较高数量级的样本，如果待测样本中目的基因的量处于反应体系的检出限附近，那么最好是使用复孔以保证结果的可靠性。 标准曲线的影响，对于必须进行绝对定量的研究，标准曲线是必不可少的，虽然标准品和样本之间的差异始终存在，但是制作一个好的标准曲线对定量结果至关重要，在制作标准曲线时，应至少选择5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围，理想的标准品应与样本具有高同源性，最好是选择纯化的质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA（用于RT-PCR），在制备过程中，应使用规范的步骤或是根据所购买的试剂盒提供的标准操作手册进行。 Real time PCR的问题及解决方案 Realtime PCR的重现性很差怎么办？ 如果有可能尽量选择体积较大的测试体积（50μl)。 避免人为地失误（错加，漏加等) 如果可能尽量选择板子中间作为实验孔 反应之前进行离心以便消除泡沫和粘挂在管壁上的样品 重复孔，并且使用Master mix 加入管家荧光ROX Real time PCR的问题及解决方案 非特异性的信号怎么解决？ 反应体系中形成的引物二聚体 非特异性扩增 由于SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合,所以会在反应体系中出现特异性产物与引物二聚体竞争SYBR Green I的现象,从而降低了实时PCR的敏感性。要解决这个问题，有多种方案可供选择，首先可以用水解探针代替SYBR Green I，虽然水解探针并不能消除引物二聚体的或者非特异性扩增的形成，但是在定量检测时，它却可以避开二者的干扰，专一地测定来自于特异产物的荧光信号。 可以使用热启动办法，所谓热启动是指在反应体系达到引物退火温度时才加入某一反应成分，因为引物二聚体和非特异性扩增是在各种试剂一经混合便开始形成的，所以用这种方法能有效地减少二者的形成 要尽可能地优化引物设计，例如所设计的两条引物不能互补（尤其在3’端），使两条引物的GC含量大致一致，使用纯化的引物进行实验等，这些都是防止引物二聚体形成的根本因素。 Real time PCR的问题及解决方案 非特异性的信号怎么解决？ 如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。 在实验过程中应当注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。 读取荧光信号的时候采用高于因物而聚体的熔解温度来读取。 人为问题（漏加、错加） 非特异性扩增以及引物二聚体 各种条件的优化 时间很长 解决方法： 明显的加样指示剂 热激活的酶 已经优化好的条件 Real time PCR的问题及解决方案 Contact us www.AB 800-810-0242 Yang.sun@ Q＆A 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * * * The world leader in serving science * Realtime PCR的原理和应用 Yang Sun, PhD Product Specialist 主要内容 Realtime PCR的原理 Realtime PCR的应用 Realtime PCR的问题及解决方法 Real Time PCR的概念 Real time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 Ct值 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 Real time PCR的原理 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log