基于Staphylococcus_省略_缩酶在大肠杆菌合成稀有酮糖的研究_李子杰.pdf技术报告.docVIP

研究报告 DOI: 10． 13995 / j． cnki． 11 － 1802 / ts． 201508002 基于 Staphylococcus carnosus 来源的 D-果糖-1，6-二磷酸 醛缩酶在大肠杆菌合成稀有酮糖的研究* 李子杰，贺贝贝，高晓冬 ( 江南大学 生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 摘 要 将 Staphylococcus carnosus 来源的 FruAS. car 醛缩酶基因 fda 和大肠杆菌来源的 YqaB 磷酸酶基因 yqaB 分 别插入到表达质粒 CDFDuet-1 得到重组质粒 CDF-fda-yqaB，并转化该重组质粒到大肠杆菌 BL21Star( DE3) 。以 同时过量表达 FruAS. car 醛缩酶和 YqaB 磷酸酶的大肠杆菌 BL21Star ( DE3) / CDFDuet-1-fda-yqaB 作为发酵菌株， 以葡萄糖为碳源通过糖酵解途径在胞内生成供体磷酸二羟基丙酮，分别在培养基中添加丙醛、丁醛为受体，进行 相应稀有酮糖的合成，从而成功地将羟醛缩合反应在大肠杆菌中实现，酮糖产物用 HPLC 检测并进行纯化和1 H NMＲ 鉴定。最后，以13 C 同位素全标记的葡萄糖为碳源，添加丙醛为受体进行了同位素标记实验，证实了产物从 DHAP 而来的 3 个碳原子最终来自葡萄糖。 关键词 醛缩酶; 磷酸酶; 稀有酮糖; 大肠杆菌  醛缩酶介导的羟醛缩合反应是合成手性 C-C 键 ［1 － 3］ ， 的最重要方法之一 。对于醛缩酶来说 磷酸二羟 基丙酮( DHAP) 依赖型醛缩酶研究最为广泛。该类 醛缩酶催化 DHAP 供体分子与醛受体分子的羟醛缩 合反应，醛缩酶能够决定产物中两个新生成的立体中 心的构型［4］，并且不受底物的结构或立体化学的影 响［5］。D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶( FruA) 活性高、能 够以多种醛作为受体，是应用最为广泛的 DHAP 依 赖型醛缩酶。FruA 对 DHAP 分子的专一性要求非常 高［6］，由于 DHAP 成本昂贵并且稳定性较差，不利于 产物的大量制备［6 － 8］。 在前期工作中，基于“一釜四酶法”的策略，以外 消旋的 DL-3-磷酸甘油作为起始底物在磷酸甘油氧 化酶的作用下生成 DHAP，同时与 FruAS. car 醛缩酶 ( Staphylococcus carnosus 来源) 催化的羟醛缩合反应 ， ［9］ 偶联 制备了多种酮糖 。虽然能够避免直接使用 DHAP，在一定程度上节约了成本，但没能从根本上 实现 DHAP 的大量合成问题。在本研究中，以便宜 的底物葡萄糖作为碳源，通过糖酵解途径在同时表达 FruAS. car 醛缩酶和 YqaB 磷酸酶大肠杆菌工程菌胞内 产生 DHAP，并分别在培养基中添加醛受体丙醛、丁 第一作者: 博士，副教授( 高晓冬教授为通讯作者，E-mail: xdgao @ jiangnan． edu． cn) 。 * 国家 自 然 科 学 基 金 () ; 中 国 博 士 后 科 学 基 金 ( 2014M551500) 收稿日期: 2015 － 03 － 31，改回日期: 2015 － 05 － 12  醛合成相应的稀有酮糖。 材料与方法 1 质粒和菌株 CDFDuet-1 质粒和大肠杆菌 BL21Star ( DE3 ) ， Novagen 公司; pKK-fda 质粒由 Fessner 教授提供; 大 肠杆菌 MG1655 和 DH5α 本实验室保存; 用于基因扩 增的引物在上海生工合成( 表 1) 。 表 1 本研究所用引物 Table 1 Primers used in this study 引物 序列 CDF-fda-F 5 ＇-GCGCGGATCCGAACCAAGAACAATT-3＇ ( BamHI) CDF-fda-Ｒ 5 ＇-GCGCCTGCAGTTAAGCTTTGTTTACTGAA-3＇( PstI) CDF-yqaB-F 5 ＇-GCGCCATATGTACGAGCGTTATGCAGGTT-3＇( NdeI) CDF-yqaB-Ｒ 5 ＇-TATACTCGAGCAGCAAGCGAACATCCACG-3＇( XhoI) 1. 2 酶、试剂和培养基 DNA 聚合酶从 Invitrogen 公司购买; 限制性内切 酶和 T4 连接酶购于宝生物公司; 链霉素、M9 无机盐、 盐酸硫胺素购自 Sigma-Aldrich; 硅胶购自 EMD Chemicals 公司。 LB 液体培养基( g / L) : 胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，121 ℃ 湿