实验四观察鞭毛菌的运动、细菌鞭毛染色技术报告.docVIP

实验四 观察鞭毛菌的运动、细菌鞭毛染色 13生物基地 201300140059 刘洋 2014-10-28 同组者：吕赞 刘沛余 马华峥 实验器材 菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）1~2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 溶液和试剂 0.01%美蓝水溶液、硝酸银染液AB液 仪器和其他用品 酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，载玻片夹，滴管，无菌水等 实验目的 学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征。 巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。 实验原理 1.菌种压滴法观察活菌运动 鞭毛的功能相当于船的螺浆，在水中可以高速旋转从而推动菌体前行，鞭毛马达还可以转向（从反时针旋转变为顺时针旋转）从而使菌体发生翻滚进而改变细菌的运动方向，事实上细菌在游动时也并不是单纯地一直朝前游，而是伴随着不时的随机翻滚转向，但从表观上看仍表现为细菌的前行。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。鞭毛的细菌运动活泼，且不同时向一个方向运动，而无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。这样便可以在光学显微镜下观察到细菌的运动。 2.鞭毛染色 鞭毛是细菌的纤细丝状运动“器官”。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为10~30mn，只有用电镜才能直接观察到。若要用普通光学显微镜观察，必须使用鞭毛染色法。首先用媒染剂（如单宁酸或明矾钾）处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difeo氏染色法）进行染色。 实验步骤 压滴法观察活菌活动 1.涂片 取一块载玻片，在中央滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作从枯草芽孢杆菌（铜绿假单孢菌)斜面上挑数环菌置于载玻片液滴上，小液滴呈混浊状即可。 染色（可省略） 取一滴0.01%美蓝溶液滴在小液滴上。 盖片 滴完染色剂后，用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，防止产生气泡。（盖片要迅速） 镜检 盖片完成后迅速拿到显微镜下观察，将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。（若观察不到，可用油镜） 鞭毛染色（硝酸银染色法） 载玻片准备 将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20min，然后用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹 菌液制备 无菌操作用接种环由普通变形菌14~18h牛肉膏蛋白胨半固体新鲜培养物平板上挑取数环菌落边缘菌体，悬浮于1~2mL无菌水中制成轻度浑浊的菌悬液，不能剧烈震荡。 制片 取一滴菌悬液滴到洁净载玻片一端，倾斜玻片，使菌悬液缓慢流向另一端，用吸水纸吸去多余菌悬液，自然干燥。 染色 滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3~5min后用蒸馏水充分洗去A液。用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面数秒至1min，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。 镜检 用油镜镜检检查。 注意事项 选用活跃生长期菌种进行鞭毛染色，老龄菌鞭毛易脱落。 载玻片必须清洁、光滑、无油迹，否则菌液不能散开，造成菌体堆积，鞭毛相互纠缠而难以看清，而且染色后背景脏乱。 制片过程中条件要温和，不能剧烈震荡、涂抹菌液，也不能采用加热法进行固定，否则鞭毛易脱落。 按要求配制合格的染液。 硝酸银染液B液染色时间的掌握和Leifson氏鞭毛染液最佳染色时间的确定是本实验能否成功的关键环节。 实验结果及分析 被杀死的铜绿假单胞菌 运动的枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌 观察到周生鞭毛的枯草芽孢杆菌 观察到端生鞭毛的铜绿假单胞菌 结果分析 1.铜绿假单胞菌一开始被杀死的原因可能是染色时间过长。 2.铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌在压滴法观察中向各个方向运动，可以推断均有鞭毛。 3.枯草芽孢杆菌长杆状，菌体长短不一但宽度一致，为周生鞭毛，鞭毛数量多。 4.绿假单胞菌两端钝圆短杆状，为端生鞭毛，鞭毛数量少。 思考题 除鞭毛染色法外，还有什么办法能观察到鞭毛？ 可直接在电子显微镜下观察，电子显微镜放大倍数高，可以观察到鞭毛。 你对你所做的鞭毛染色结果满意吗？如果不满意，有哪些方面需要改进？如果满意，你的成功经验是什么？ 不是很满意，冲洗A液时有时水流过大使得鞭毛脱落，染色时间控制还不得当。 如果你发现鞭毛已与菌体脱离，请解释原因。 （1）可能是菌龄过大，自然脱落； （2）操作时玻片受到较强烈的震