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* * * (二)固相酶免疫测定固相酶免疫测定特点：(solid phase enzymeimmunoassay，SPEIA), 1、利用固相支持物作载体预先吸附抗原或 抗体； 2、使测定时的免疫反应在其表面进行并形成 抗原抗体复合物； 3、洗弃反应液中无光物质并加入酶底物后, 4、通过测定固相载体上的酶标记物催化底物 生成的有色产物,确定样品中抗原或抗体 的含量。 第三节 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(ELISA)于1971年分别由瑞典学者Engrall和Perlman,荷兰学者VanWeeman和Schuurs报道. 它开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法。 基本原理： 1、把抗原或抗体预先结合到固相载体表面 (在不损坏其免疫活性的条件下); 2、测定时,将受检样品(含带测抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物; 3、反应终止时,固相载体上的酶标抗原或抗 体被结合量(免疫复合物)即与标本中待检 抗体或抗原的量成一定比例; 4、经洗涤去除反应液中其它物质,加入酶底 物后, 5、底物即被固相载体上的酶催化变为有色产 物, 6、最后通过定性或定量分析有色产物量即可 确定样品中待测物质含量。 二、方法类型 以下举例介绍几种常用的检测Ag方法。 1、双抗体夹心法 双抗体夹心法，属非竞争结合测定。 它是检测抗原最常用的ELISA， 适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的 多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 基本工作原理： 1、是利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。 2、由于固相抗体和酶标抗体的量相对于待检抗原是过量的。 因此复合物的形成量与待检抗原的含量成正比。 3、测定复合物中酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待检杭原含量 图10-4 双抗体夹心ELISA测定原理示意图 双抗体夹心法测抗原 + - E E E E E E E E E 2、双位点一步法 3.竞争法 特点： ①酶标抗原与样品或标准品中的非标记抗原与固相抗体有相同结合的能力 ②反应中,固相抗体和酶标抗原是固定限量 ③反应后,结合于固相载体上的复合物中被测定的酶标抗原的量(酶活性)与样品中非标记抗原的浓度成反比. 竞争法测抗原 + - E E E E E E E 2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3、加酶作用 的底物显色 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合 E 以下举例介绍几种常用的检测Ab方法。 1.间接法 此法是测定抗体最常用的方法，属非竞争结合试验。 原理： （1）将抗原联接到固相载体上，样品中待检抗体与抗原结合成固相抗原-受检抗体复合物； （2）再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物； （3）测定加底物后的显色程度，确定待检抗体含量 间接法：采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),具有更广的通用性。 间接法测抗体 - E E E E E E E E E + 2、双抗原夹心法 抗原包被 阳性血清(含抗体) 洗涤 加酶作用底物 加终止液 竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 3、竞争法测抗体 E E E 2、加待检抗体与酶标抗体竞争与抗原 结合 3、加酶作用的底物，显色强弱与待测抗体成反比 3、加酶作用 的底物显色，显色强弱与待测抗体成反比 1、已知抗原包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待测抗体 和酶标抗原，待测抗体与固相抗体竞争与酶标抗原结合 E E E E 4.捕获法 （亦称反向间接法）ELISA， 主要用于血清中某种抗体亚型成分 （如IgM）的测定。 捕获法原理 + - E E E E E 1、固相化抗人 　IgM 1、固相化抗人 　IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合 4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色 2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合 4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色 5.其他ELISA  生物素-亲和素放大系统的ELISA；