专题1《基因工程》专题解读.pptVIP

1. 载体的必要条件 能自我复制，或能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达； 有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。 具有某些标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 1、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库. 基因文库 基因组文库 部分基因文库 （如:cDNA文库） 基因文库 如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。 是否一定要构建基因文库？ 未知目的基因序列时 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：___________、_______________、___________ 、 ___________ . ②原理：__________ 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 模板DNA 四种脱氧核苷酸 DNA引物 热稳定DNA聚合酶 2.利用PCR扩增目的基因 已知目的基因序列时 ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 ④过程 a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 3.人工合成 ——根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 已知核苷酸序列的较小基因可以化学合成，不需要模板。 质粒 目的基因 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 表达载体 同一种 1.过程 二、基因表达载体的构建——核心 限制酶切割位点的选择必须保证目的基因，标记基因的完整性，以便于检测和表达。 a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？ 2、基因表达载体的作用 3.基因表达载体的组成： 它们有什么作用？ a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 位于基因的首端,是mRNA结合位点 位于基因的末端,终止转录 检测目的基因是否导入受体细胞 基因表达载体 1、组成： 目的基因 + 启动子 终止子 标记基因 + + + 复制原点 2、目的基因、启动子、终止子不是质粒上固有的，标记基因、复制原点是质粒上固有的。 3、如果目的基因是从基因组文库中获取的，因为目的基因本身已含有启动子、终止子，在构建表达载体时，就不需要在加启动子、终止子。如果目的基因是从部分基因文库中获取的，因为目的基因本身不含有启动子、终止子，在构建表达载体时，就需要在加启动子、终止子。 4、单切酶法与双切酶法 单切酶法就是用同一种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，形成相同的黏性末端，可用DNA连接酶连接重组DNA。由于单切酶切割后目的基因的前后各有一个互补的黏性末端，这两个互补的黏性末端会发生碱基互补配对使目的基因前后相连，形成自身连接，自我环化。同理质粒在DNA连接酶的作用下也会出现前后相连，形成自身连接。 双切酶法就是用两种不同的限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，使它产生两个不同的黏性末端，此时目的基因、载体就不会发生自我环化。而且在DNA连接酶的作用下，载体只能与目的基因的相应末端互补连接成重组质粒。 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 三、将目的基因导入受体细胞—转化 2 1、将目的基因导入植物细胞 ①农杆菌转化法 ②基因枪法 ③花粉管通道法 2、将目的基因导入动物细胞 显微注射技术：将基因表达载体提纯，用显微仪 注射到受精卵中 3、导入微生物细胞 ①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 ②方法： 受体细胞 受体细胞的种类：动物