分子生物学实验技能摘要.ppt

8. Northern blot Northern blot 原理： 通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。 分子探针的类型 cDNA probe：杂交反应有较高的专一性。因其为双链结构，需加热变性解链。解链后只有半数DNA链与特定的mRNA杂交，另一半DNA链则与mRNA竞争，并导致DNA链的自我“退火”（既重新形成双链）。 mRNA probe（互补的RNA）：为单链结构，杂交反应专一性高，杂交链稳定，制备复杂。 Oligonucleotide probe:由DNA合成仪合成，制备简单，由于链不长，又是单链，较易穿过组织，操作方便，但杂交链因其链短而不够稳定。 首先需要从组织或细胞中提取总RNA ,或者再经过寡聚（dT）纯化柱进行分离纯化得到mRNA。然后RNA样本经过电泳依据分子量的大小对被分离，随后凝胶上的RNA分子被转移到膜上。膜一般都带有正电荷，核酸分子由于带负电荷可以与膜很好的结合。转膜的缓冲液含有甲酰胺，它可以降低RNA样本与探针的退火温度，因而可以减少高温环境对RNA降解。RNA分子被转移到膜上后须经过烘烤或者紫外交联的方法加以固定。被标记的探针与RNA探针杂交，经过信号显示后表明需检测的基因的表达。Northern blot实验中阴性对照可以采用已经过RT-PCR或基因芯片检测过