a基因克隆简介解读.pptVIP

2）. 转化方法 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?gDNA）。 （2）电转化法 简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置10分钟 42oC 1分钟 加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA 热休克法 感受态细胞是指能够结合和摄取外源DNA并发生遗传转化的细胞。 1）常用筛选方法 （1）抗药性筛选 （2）营养标记选择 （3）β-半乳糖苷酶显色选择反应选择法 2）常用重组体鉴定方法 （1）酶切鉴定 （2）PCR鉴定 （3）杂交鉴定 4.阳性克隆的筛选与鉴定 5. 目的基因的表达 1）原核表达系统； 2）酵母表达系统； 3）哺乳动物表达系统； 4）植物表达系统。 外源DNA 载体DNA 重组分子 原核细胞 真核细胞 扩增或表达 表达 连接 转化或转导 电穿孔或显微注射 受体细胞 筛选阳性克隆 筛选阳性克隆 * * * * 显色反应的平板，白色菌落为有插入片段的克隆 * * * * * * * * * * 抗药性标志的选择 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的筛选标记基因。如pUC系列载体。 2.7kb Ｏ Ｐ Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。 lacZ的a肽互补蓝白斑选择原理： ① 乳糖操纵子 异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside：IPTG）结构上类似于别乳糖，是乳糖操纵子非常有效的诱导物。可诱导lac操纵子表达，但不能被β-半乳糖苷酶水解。 ② 异丙基硫代半乳糖苷 IPTG 异丙基 硫代-β-D-半乳糖苷 Isopropyl-beta-D-thiogalactoside ③ Xgal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside） 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖糖苷 b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝 b-半乳糖苷酶 lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）： b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），该段基因序列连接到pUC载体上。 受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成活性酶，不能分解Xgal pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又能分解Xgal。产生蓝色物质。 C端大部分 N端的11-41aa pUC lacZ’ 受体菌lacZ 载体lacZ’与a互补 a互补的插入失活 pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。 lacZ’ 5’ 3’ a肽移码突变 lacZ’ 5’ 3’ a肽 不互补 互补 MCS 外源DNA 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。 MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。 IPTG诱导的结果： 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 T7启动子 SP6启动子 MCS lacZ’ Ampr ori 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1）基因文库的构建 （1） 基因文库（gene library） 1.目的基因片段的获得 四. DNA 的克隆过程 （2） 基因组文库的构建 1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大小的 DNA 片段， 2、载体DNA的制备； 3、DNA 片段与载体连接与包装 ； 4、重组噬菌体侵染受体菌； 5、基因文库的鉴定和扩增 原位杂交，是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之固定在滤膜上并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。 原位杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆，当得到阳性克隆后，再通过 Southern 杂交进一步验证。通过这种方法在一张直径为 9cm 的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。 （3 ）基因