第十一章生物素-亲和素系统相关技术课件资料祥解.pptVIP

生物素-亲和素放大技术 王强 川北医学院医学检验系 E-mail：wqiang_1981@126.com 主要内容 一、生物素-亲和素系统（BAS） 一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点 一）生物素及活化生物素 (一)生物素 3.结构： (二)活化生物素 生物素与蛋白质的结合 1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。 2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）。 3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。 4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。 1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。 2.标记蛋白质醛基：生物素酰肼（BHZ）、肼化生物胞素（BCHZ） 标记对象： 大分子活性物质：如抗原、抗体。标记后不影响免疫活性。 酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。会降低ALP的活性。 活化生物素可与不同的大分子物质结合，应根据可标记基团的种类及特性，选择相应的活化生物素； 抗体：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素 一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即生物素化大分子具有多价性，它是BAS多级放大作用的物质基础。 但每个蛋白质上标记的生物素分子数量应控制在一定范围。 每个抗原标记1-3个生物素分子为宜； 每个抗体标记3-5个生物素分子为宜； 生物素：IgG(mg/mg)=2:1，效果较好。 一、生物素-亲和素系统（BAS） 一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点 二）亲和素和链霉亲和素 (一) 亲和素(avidin，A) 二）亲和素和链霉亲和素 (二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ： 标记对象： 大分子物质：如酶、抗原和抗体。 小分子物质：胶体金、FITC和化学发光物等。 一、生物素-亲和素系统（BAS） 一) 生物素及活化生物素 二) 亲和素及链霉亲和素 三) 生物素-亲和素系统的特点 三）生物素-亲和素系统的特点 可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、间接法、竞争法等，在此基础上引入A-B系统。 BAB法： BA法： ABC法： BAB法： Ab·B A Ab·B-A B·? Ab·B-A-B· ? 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E；Ab·B和A-B的两次放大效应，可提高灵敏度。 BA法： Ab·B A· ? Ab·B-A· ? 特点：省略加标记生物素步骤，操作较BAB法简便；Ab·B的放大效应，该法有相当高的灵敏度。 ABC法： ⑴ A+B· ? A- B· ? ----------ABC ⑵ Ag+Ab·B Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-ABC 特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC；操作比BAB法简便，但仍然保持较高的灵敏度。 三、 生物素-亲和素系统的应用 1、BAS在酶免疫技术中的应用 2、BAS在荧光免疫技术中的应用 3、BAS在放射免疫技术中的应用 4、 BAS在分子生物学中的应用 免疫-PCR 免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。 PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。 免疫-PCR 一、主要程序 1. 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物； 2. 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物； 3. 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA； 4. PCR扩增生物素化DNA部分。 二、免疫PCR的发展 免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的还不多； 实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。 在报道的文献中均采用待检抗原直