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第二章 生物工程的一般技术 细胞培养环境 动植物细胞的培养是在人工环境下进行的。这种人工环境除了要能满足培养的生物有机体正常生长和分裂所需营养物质以外，还要保证清洁，没有其他微生物的污染和有害因素的影响，换句话说，细胞培养过程是在无菌条件下进行的。 细胞培养中常见的污染物及危害 一、细菌 a革兰氏阳性菌：常见有枯草芽孢杆菌等； 大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。可以选择青霉素族，头孢曲松钠等。 b 革兰氏阴性菌：大肠杆菌、假单胞菌等。 大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病.常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等。革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感,可以选择氟喹诺酮类药物如诺氟沙星，左氧氟沙星等，也可以选择大环内酯类比如克拉霉素、罗红霉素等。 革兰氏染色法 用结晶紫液加碘液染色，再用95%酒精脱色，然后用稀复红液染色。经过这样的处理，有的细菌被染成紫色，是革兰氏阳性菌，有的被染成红色，是革兰氏阴性菌。 受到细菌污染后，培养液会变浑浊，ph会发生变化，细胞的正常生命活动受到影响，发生生理病变，最终死亡。 二、真菌 真菌，是一种真核生物。 生活中最常见的真菌是各类蕈类， 另外真菌也包括霉菌和酵母。 受真菌污染的危害 收到真菌污染后，培养液一般不浑浊，但在培养液中可见白色或黄色的小点或小球，在显微镜下观察这些点，可见丝状、管状或树枝状的菌丝密集交错而成。培养液中的真菌会利用培养基中的养分迅速成长，因而使培养细胞的生长变慢，最终因缺乏营养与毒害作用而死亡。 三、其他污染因素 支原体 病毒 非同种细胞 因此 控制污染是细胞培养的关键！ 第一节 细胞培养无菌操作与常用设备 定义： 用于培养系统的无菌状态和防止微生物进入无菌范围的一系列操作技术 一、细胞培养无菌操作要点简介： 1、进行无菌操作前，必须带好帽子、口罩，用洗涤剂洗净双手并擦干。 2、进行无菌操作时首先将双手和手臂用70%酒精消毒。 3、操作动作要轻。无菌镊子夹取物品。火焰周围打开盖子，并在火焰周围消毒。 4、操作时不要说话，打喷嚏等； 5、每次操作时要注意注意酒精灯火焰上灼烧接种针、手术刀等。注意移液器的吸头是一次性的 ，每次必须更换。不小心接触手或其他物品时，应丢弃。 6、每次操作结束时都要将接种针等在火焰上灼烧。清洁操作台并用消毒水泡纱布擦净台面。 7、细胞培养所用物品必须清洗、消毒彻底，溶液必须高压灭菌或过滤除菌。吴俊物品必须保存在无菌包内或灭菌容器中，不可暴露在空气中。无菌与有菌分开放置。无菌包一旦打开即不能视为绝对无菌，尽早使用。凡已经取出的无菌物品虽未使用也不可在放回无菌容器内。 8、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并检查无菌包或容器是否过期。 9、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装的过满，以免取用时碰到容器外面被污染。 10、保持无菌操作室的洁净干燥、空气清新。定期对操作室及剩余的无菌器皿进行消毒。 二、细胞培养常用器材及灭菌方法 1、玻璃器材。 首次使用的玻璃器材：自来水---1%稀盐酸浸泡过夜---自来水。 重复使用的玻璃器材：软刷子和中性洗涤剂刷洗---放入洗液（K2Cr2O7和浓H2SO4配成）12-24小时，----自来水冲洗10次以上---单蒸水3次------双蒸水1次，晾干----包装----121度高压蒸汽灭菌20min 2、塑料器材 培养皿 吸头 多孔培养板等 初次可直接使用 重复使用的塑料器材 自来水，晾干-------3%Hcl或者2%Naoh浸泡过夜--------自来水----双蒸水3次----晾干---紫外灯照射。 3、橡胶器材 塞子、盖子 1新橡胶器材 自来水-----5%NaOH煮沸15min ---自来水8次----4%hcl煮沸15min—自来水8次----单蒸水3次---双蒸水1次。 2旧橡胶制品 自来水-----洗衣粉煮沸10min---自来水洗搅—蒸馏水煮沸2次 每次15min ---单蒸水2次----双蒸水1次。 3包好或至于铝盒内 高压蒸汽灭菌20min 4金属器材 镊子、剪刀 针头 新金属器材 纸擦油---洗衣粉煮沸（或1%碳酸氢钠）煮沸15min，---- 95%酒精纱布擦干---包装或者铝盒----高压蒸汽灭菌20min 旧金属器材 酒精---包于铝盒内---高压蒸汽灭菌20min