人类细胞质RTPCR的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用精要.ppt

RNA电泳结果 rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。 RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。 RT-PCR RT-PCR：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。是一快速、简便、敏感性极高的检测RNA的方法。 RT-PCR的原理 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR的应用 分析基因的转录产物 获取目的基因 合成cDNA探针 构建RNA高效转录系统 * RT-PCR的步骤 提取原理 、方法 逆转录酶、引物 提 取 总RNA 合成cDNA 原理体系 引物选择 PCR 电泳原理 电泳步骤 电 泳 提 取 总RNA 合成cDNA PCR 电 泳 逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNA－cDNA。 逆转录反应 (RT) AAAAAA(n) mRNA AAAAAA(n) 3?-TTTTTT(18)-5? 68-70oC, annealing AAAAAA(n) 3?-TTTTTT(18)-5? 37-42oC, RTase mRNA mRNA cDNA 10min 1-2h RT RT-PCR的逆转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； 2、Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 常用的逆转录酶有两种：鸟类成髓细胞性白血病病毒（AMV)反转录酶 莫罗尼鼠类白血病病毒（MMLV)反转录酶 合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。? ?? 合成cDNA引物的选择 2．?Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 合成cDNA引物的选择 3．异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA?3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 PCR PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 PCR产物在琼脂糖凝胶上的 电泳检测 在基因组DNA的提取中，用蒸馏水溶解提 取出的DNA，在1.0%的琼脂糖胶进行电泳，以 Marker(分子质量标准)作为参照，用≤5V/cm的电泳30-60分钟，最后采用EB溶液进行染色后在凝胶成像系统中进行观察拍照。 结果初步分析 数量分析：条带的宽度， 荧光的亮度。 质量分析：纯度 分子量 * * “ ” “ ” 人类细胞质、RT-PCR的原理、方法