实验八GUS组织化学定位要点.ppt

37度培养12-14h，会长出如上图所示的单菌落（乳白色、浑圆、饱满、菌落高度明显突出培养基表面）。 培养时间过长，比如超过16小时，在这些单菌落周围会出现一小密集的像针尖一样大小的菌落，称为卫星菌落。这说明，培养的时间太长了。 卫星菌落 有些载体带有β-内酰胺酶的基因，表达出β-内酰胺酶，它可以破坏氨卞青霉素。当细菌培养时间过长，β-内酰胺酶积累过多，就会使周围的氨卞青霉素失效，导致不含质粒的空菌落大量生长，这就是卫星菌落。 实验七、转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测 如何检测基因的组织特异性表达？ 基因的组织特异性表达主要是由该基因特异性启动子决定的。即，某些启动子有组织特异性，它会启动该基因的特异性表达。 启动子没有基因特异性，它会启动任何下游基因的表达。 只要知道启动子在什么部位表达，就可以推测出该启动子所启动的基因的表达部位。 启动子的表达如何才能肉眼可见呢？——连接报告基因（GUS,分解底物呈蓝色）。 基因的组织特异性表达 原 理 GUS基因就是转β-葡萄糖醛酸酶基因 ，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。 由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中（作为报告基因）。根据gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。　　 组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。 本实验材料中使用的转基因载体的部分图谱 RB LB NPT П GUS NOS - ter pBI101 NOS - ter 35S - pro RB LB NPT П GUS NOS - ter pBI101 NOS - ter 35S - pro RB LB NPT П GUS NOS - ter pBI101 NOS - ter 35S - pro RB LB NPT П GUS NOS - ter NOS - ter 35S - pro AK12- pro 克隆拟南芥中的AK12基因的启动子，插入到PBI101载体GUS基因上游的克隆位点（具体图示如下） 农杆菌转化 转化拟南芥 新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性） nopaline?synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶 RB LB NPT П GUS NOS - ter pBI101 NOS - ter 35S - pro RB LB NPT П GUS NOS - ter pBI101 NOS - ter 35S - pro RB LB NPT П GUS NOS - ter pBI101 NOS - ter 35S - pro RB LB NPT П GUS NOS - ter NOS - ter 35S - pro AK12- pro PBI101载体 花椰菜花叶病毒( CaM V)启动子 本实验基本流程  拟南芥AK12-pro 种子萌发，长成幼苗 取幼苗 组织化学检测 -- GUS检测 报告基因GUS的表达的检测 材料：拟南芥AK12-pro 试剂： GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml，4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc，再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备用。 组织化学染色检测 -- GUS染色 取2支1.5ml离心管，各加入0.5ml 1mol/L GUS染色液； 用镊子夹取 转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心管中； 37℃浸泡2-5h（或过夜）；（晚上继续下面的脱色和照相步骤） 倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色；肉眼下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现蓝色。 实验报告 转基因作物的检测 新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性） nopaline?synthase(NOS)gene