酵母双杂交教案详解.ppt

SMART合成cDNA 共转化，涂板 培养，收集菌液 文库分装，冻存 1ml mating * * 酵母双杂交系统技术介绍 文库构建: Clontech MM文库构建方法 文库构建: Clontech MM自制文库筛选 SMART合成cDNA 共转化，涂板 培养，收集菌液 文库分装，冻存 1ml mating DDO/X/A 混合 QDO/X/A * * 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选: Clontech MM文库筛选 630489 Matchmaker? Gold Yeast Two-Hybrid System 630489 Y187 Y2H Gold 三个载体 阳性对照， 阴性对照。 BD vector：pGBKT7 AD vector: pGADT7 630439 极大提高转化率 可以单独购买 * * 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选: Clontech MM 系统质粒 诱饵载体 In Y2H Gold * * 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选: 诱饵载体构建及其自激活检测 * * 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选: Mating方法筛选 Y187 α型 DDO筛选 二倍体 Y2H Gold a 型 Mating 接合反应 酵母的有性生殖过程， Clontech利用这个过程，实现了文库筛选。 Mix Mating QDO筛选 * * 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选: 均一化通用文库筛选 均一化通用型文库 高丰度与低丰度均衡 大大降低工作量 大大降低假阳性 更高的基因代表性 Normalized Universal Pre. library DDO/X/A 混合 QDO/X/A * * 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选: 传统细菌文库筛选 文库培养 提取质粒 转化酵母菌 取1ml菌液按照一定比例用LB稀释，150ul/板进行涂板，过夜培养。 将提取的质粒转化Y187，获得酵母文库。 Mating筛选 将文库与诱饵培养液混合，进行Mating。涂筛选板，挑取阳性克隆子。 刮取平板上的菌落，提取质粒。 * * 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选: 验证阳性克隆子（PCR确认） 25ul 2×mix 30 PCR cycles 25ul H2O 630497 Matchmaker? Insert Check PCR Mix2 * * 酵母双杂交系统技术介绍 文库筛选: 酵母质粒提取 630467 Easy yeast Plasmid Isolation Kit * * 酵母双杂交系统技术介绍 验证互作: 体内验证 SEAP 630305 Mammalian Matchmaker Two-Hybrid Assay Kit 2 * * 酵母双杂交系统技术介绍 验证互作: 体外Co-IP验证 Bait AcGFP1 PL Prey Protein A/G Agarose beads Matchmaker Chemiluminescent Co-IP Vector Set（630458） Matchmaker Chemiluminescent Co-IP Kit（630459） Prolabel Chemiluminescent Detection Kit （631723） * * 酵母双杂交系统技术介绍 验证互作: 体外Co-IP验证实验流程 PL检测 验证互作: FRET分析 632466 pDsRed -Monomer-C1 Vector 632470 pAcGFP1 -C1-Vector * * 酵母双杂交系统技术介绍 Clontech Matchmaker系统产品选择指南 * * 酵母双杂交系统技术介绍 The FRIGIDA Complex Activates Transcription of FLC, a Strong Flowering Repressor in Arabidopsis, by Recruiting Chromatin Modification Factors K Choi, J Kim, HJ Hwang, S Kim… - The Plant Cell …, 2011 - Am Soc Plant Biol Extracellular signal-regulated kinase 8 (Erk8) controls estrogen-related receptor α (ERRα) cellular localization and inhibits its transcriptional activity M Rossi, D Colecchia, C Iavar