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苏州大学 细胞生物学经典综合题 1. GFP是什么?叙述其在生物学研究中的应用。 答：GFP是绿色萤火蛋白，对特异蛋白质等生物大分子定性定位用，将GFP基因与某种蛋白基因融合，在表达这种融合蛋白的细胞中，可直接观察到该蛋白的动态变化 应用：1通过荧光抗体免疫标记实验证明了膜蛋白的流动性。用抗鼠细胞膜蛋白的荧光抗体（显绿色荧光）和抗人细胞膜蛋白的荧光抗体（显红色荧光）分别标记小鼠和人的细胞表面，然后使两种细胞融合，10min后不同颜色的荧光在融合细胞表面扩散，40min后可观察到绿色荧光和红色荧光均匀的分布在融合细胞表面，这一实验显示了与抗体结合的膜蛋白在质膜上的运动。在某些细胞中，当荧光抗体标记时间继续延长，已均匀分布在细胞表面的标记荧光会重新排布，聚集在细胞表面某些部位，即所谓成斑现象或聚集在细胞一端即成帽现象，这两种现象进一步显示了膜蛋白的流动性。但膜蛋白并不都是自由运动的，膜蛋白因为与细胞骨架结合而限制了膜蛋白的运动 2. 如何利用细胞同步化方法研究细胞生物学? 答：细胞同步化方法经常用于研究细胞周期中 在同种细胞组成的一个细胞群体中，不同细胞可能处于细胞周期的不同时期，为了某种目的，人们常需要整个细胞群体处于细胞周期的同一时期。自然界存在的细胞周期同步化过程称为自然同步化 周期同步化也可人工选择或人工诱导，统称为人工同步化。人工选择同步化指人为的将处于不同时期的细胞分离出来，从而获得不同时期的细胞群体。 有丝分裂选择法：如：处于对数生长期的单层培养细胞，大量处于分裂期的细胞变圆，从培养瓶壁上隆起，与培养瓶壁的附着力减弱，若轻轻振荡培养皿，处于分裂期的细胞会从瓶壁上脱落，悬浮到培养液中，离心培养液可获得分裂期细胞，将其悬浮于培养液培养，细胞开始同步分裂，同时进行细胞周期运转，由此可获得不同时相细胞，此方法被广泛采用，优点：因为未经药物处理能真实反应细胞周期情况，且细胞同步化效率高；缺点：分离的细胞数量少 密度梯度离心法：裂殖酵母不同时期的细胞在体积和重量上差别显著，可采用密度梯度离心法分离出不同时期的细胞。优点：简单省时，效率高，成本低；缺点：对大多数种类细胞不适用 药物诱导法：所有细胞被同步化在细胞周期中某一特定时期。有DNA合成阻断法和分裂中期阻断法两种 DNA合成阻断法：采用低毒或无毒DNA合成抑制剂特异抑制DNA合成，而不影响其它时期的细胞进行细胞周期运转，从而将被抑制的细胞抑制在DNA合成期的实验方法，原理：目前采用最多的DNA合成抑制剂是TdR和HU。将抑制剂加入培养液并继续培养一段时间（TG2+TM+TG1），所有细胞被抑制在S期；因为此时细胞可能处于S期中的任何时期，其时间区段仍然较宽，若去除抑制剂，细胞仍不能有效进行同步运转，因而采用两次DNA合成抑制剂处理，将细胞最终抑制在G1/S期交界处狭窄的时间区段。抑制剂去除后细胞就可进行同步细胞周期运转。步骤：将抑制剂加入培养液S期细胞立刻被抑制，继续培养一段时间（TG2+TM+TG1）后所有细胞被抑制在G1/S期交界处；洗脱TdR更新培养液后阻断于S期的细胞开始复制DNA并沿细胞周期运转;再向培养液中第二次加入TdR，培养一段时间后所有细胞被抑制在G1/S期交界处；洗脱TdR培养一段时间后可获得S期和G2期不同时间点的同步化细胞。优点：同步化效率高，适合于所有体外培养的细胞体系 分裂中期阻断：某些药物如秋水仙素等可以抑制微管聚合，能有效抑制细胞分裂器形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。处于间期的细胞受药物影响小可继续运转到分裂期，因而在药物持续存在情况下处于分裂期的细胞数量逐渐累积，将分裂期细胞培养可得大量分裂中期细胞，它可继续分裂并进行同步运转，从而获得G1期不同阶段细胞。优点：操作简便效率高；缺点;药物毒性大，处理时间过长，所得细胞不能恢复正常细胞运转 在实际工作中常把几种方法并用以获得大量同步化细胞。条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用，将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移到限定条件下培养所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。， 3. BrdU 答：用于测定细胞周期长短的标记物，通过标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定细胞周期各时期的时间长短，适用于细胞种类构成相对简单，细胞周期时间较短，周期运转均匀的细胞群体，BrdU不具放射性因而对细胞周期无干扰，检测被标记的细胞可用抗BrdU抗体作免疫细胞化学染色 4. 膜的不对称性和流动性. 答：1膜的不对称性是指膜脂和膜蛋白的不对称性 膜脂的不对称性是指同一种膜脂分子在膜的脂双层中呈不均匀分布。糖脂的分布表现出完全不对称性，其糖侧链都在质膜的ES面（质膜的细胞外表面），所以糖脂仅存在于质膜的细胞外小页。糖脂的不对称分布是完成其生理功能的结构基础。磷脂分子不对称分布可能与膜蛋白不对称分布有关 膜蛋白