制生物化学与分子生物学重组DNA技术资料讲解.ppt

常用的真核表达体系 酵母表达体系 昆虫细胞表达体系 哺乳类细胞表达体系 各种表达体系各有其优缺点，应根据具体需要进行选择 （一）酵母表达体系是最为成熟的真核细胞表达体系 酵母表达体系兼具原核和真核表达体系的优点： ① 酵母是最简单的真核生物，其在某些方面与原核细胞类 似，繁殖速度快，培养和发酵等操作也较为简单，利于工业化生产 ② 多种酵母的遗传背景较清楚，基因表达调控机制研究得较为透彻 ③ 酵母具有真核细胞的特点，能识别内含子，能对蛋白质进行一定程度地翻译后修饰，并且有分泌功能，从而方便了蛋白的纯化 ④ 不产生毒素，安全性较好 酿酒酵母表达系统的优点包括： ① 酿酒酵母广泛用于面包和乳酪工业，被FDA列为安全菌 ② 酿酒酵母的遗传背景完全清楚，便于操作与改造 ③ 基因工程中使用的酿酒酵母为营养缺陷型，通过标志补救可筛选出含有表达载体的重组细胞 酿酒酵母表达体系的不足： ① 发酵时产生的乙醇会影响酵母本身的生长以及蛋白质的产量和活性，故难于进行高密度发酵 ② 蛋白质的分泌效率低，大于30 kD的蛋白质几乎不分泌 ③ 重组蛋白常发生过度糖基化，从而丧失蛋白的正常功能 ④ 表达载体YEp不稳定，易丢失，YIp传代不高 毕赤酵母为甲醇型酵母（即能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长），毕赤酵母表达体系具有如下优势： 诱导型强启动子AOX1 高密度发酵产量很高 多拷贝整合表达量大 外源基因可稳定传代 简单易行 可进行胞内或胞外表达 表达的外源蛋白易提纯 表达的外源蛋白质量高 操作简单方便、成本较低 高表达性 高稳定性 高适用性 高分泌性 分泌蛋白的能力强 毕赤酵母表达体系也有其不足： ① 对毕赤酵母的遗传背景尚不完全清楚，因此对其进行遗传改造的难度较大 ② 发酵周期长 ③ 因密码子的偏嗜性问题或转录提前终止等原因，致使某些蛋白低表达或不表达 ④ 所表达的某些外源蛋白仍然会遭受蛋白酶的降解 ⑤ 所表达的某些外源蛋白会发生过度糖基化 多形汉逊酵母也是一类甲醇型酵母 多形汉逊酵母表达体系的优点包括： ① 该酵母是一种耐热酵母，最适生长温度为37～43℃（在49℃仍能生长），因其生长温度范围宽而易于培养和控制 ② 该酵母具有特殊的甲醇代谢途径 ③ 有多种营养缺陷株可供利用，阳性克隆筛选方便 ④ 可在所表达的外源蛋白C端加上一固定序列（S/A/C- K/R/H-L）,从而将蛋白定位于过氧化物酶体，这样既避免了蛋白酶对蛋白的降解，同时也减少了外源蛋白对细胞的毒害 ⑤ 表达载体可通过同源或非同源重组的方式，以多拷贝整合于宿主细胞基因组，从而提高表达量 裂殖酵母也可用于外源基因的表达。该酵母是一类不能出芽生殖而只能以分裂和产孢子的方式繁殖的酵母（因此定名为裂殖酵母）。与前面几种酵母相比，它具有更多的与高等真核生物相似的特性。该系统使用的表达载体有游离型和整合型载体，其中以游离型载体使用更多。该系统可以表达胞内蛋白、膜蛋白和分泌蛋白，但分泌蛋白的表达较困难，尚需进一步探索。 其他酵母表达体系也在尝试之中，如乳克鲁维氏酵母表达体系已用于人血清白蛋白、人白介素1β的表达；arxula adeninivorams酵母表达体系也已建立。 总之，酵母种类繁多，特色各异，目前，已经开发出来作为外源蛋白表达体系的只是其中极小部分，更多的还有待于深入研究。 （二）昆虫细胞表达体系能比较理想地表达真核蛋白 昆虫是高等真核生物，其与哺乳类细胞类似，具有蛋白的翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。与哺乳类细胞相比，昆虫细胞生长速度快，可不需CO2，甚至不需血清，易于悬浮培养，能较高水平地表达外源蛋白，可以胞内表达，也可以进行分泌性表达。 目前，昆虫细胞表达体系主要有杆状病毒表达体系和果蝇表达体系。 杆状病毒表达体系 以Sf9和Sf21细胞系以及家蚕为表达宿主。 表达载体的启动子采用多角体蛋白(polyhedrin)基因的强启动子。 由于杆状病毒的基因组很大，限制性内切酶位点多，难于直接进行常规克隆，所以一般采用将外源基因克隆于专门设计的转移载体上，与病毒DNA共转染细胞后，经同源重组和筛选而得到重组病毒。经重组病毒感染宿主细胞后，即可高水平表达目的蛋白。 一般情况下，杆状病毒表达体系所表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个问题，将热休克蛋白70与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平。 果蝇细胞表达体系 结合了昆虫细胞高水平表达和哺乳类