基因工程实验论文-gy介绍.docVIP

分类号: Q78 编号: 本科生基因工程实验论文 指导教师： 王郑 学 生： 阿迪雅 专 业： 生物工程 年 级： 2012级 2015 年月日磷酸酶表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 磷酸酶1369bp的碱性磷酸激酶基因片段，与pMD19-T载体连接后导入感受态的DH5α菌中筛选鉴定。用双酶切切下碱性磷酸激酶的成熟基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-his，导入?BL(21)DE3感受态菌中诱导表达碱性磷酸激酶蛋白质，用SDS鉴定。 关键词：碱性磷酸表达 引言 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)是一种非特异性磷酸单酯酶，能催化磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖，也能催化磷酸基团的转移反应[1]。AP广泛存在于微生物和动物体内，在磷生物地球化学循环过程中有重要作用并广泛应用于诊断学、生物化学及分子生物学等领域。 目前国内制备AP多采用从动物的肝脏和小肠中提取、纯化，这些方法存在着原料有限，生命成本高，不能适应生产上大量用酶的需要等弊端。而采用微生物发酵法则可克服以上缺点，微生物不受气候、地理条件的限制，繁殖较快，并可根据需要选育优良菌株来提高产酶率。 其中大肠杆菌碱性磷酸酶( Escherichia coli alkaline phosphatsae，EAP) 作为生产AP的模型得到最为充分的研究。本研究的意义在于通过基因工程的手段制备出可以表达AP的大肠杆菌，为下游的生产提供目的菌种。除了大肠杆菌外，枯草芽孢杆菌也可用于碱性磷酸酶的制备，二者都属于细菌碱性磷酸酶(Bacterial?alkaline?phosphatase,?BAP)。 对于碱性磷酸酶的相关研究，已从过去动物源性的研究占主导发展到微生物源性占主导，从主要研究其在水生动物中的作用与影响，扩展到其他的生物领域。而且制备手段从简单的提取、纯化，发展到通过构建微生物菌株来批量生产，开发了新的方法，降低了成本。最近研究表明，肠型AP在保持肠道平衡中发挥重要作用，膳食可以影响它的活性，肠型AP具有参与调节碳酸氢盐分泌和十二指肠pH、通过脱磷酸作用控制细菌内毒素诱发的肠道炎症等功能[2]。 就EAP而言，该酶是同源二聚体蛋白[3]，其单体前体的 N 端有一段22个氨基酸残基的疏水信号肽序列，可引导 EAP 转运到胞周质间隙［4-6］，有限的周质空间使得产物的表达量很低，致使EAP 制备效率低、成本高。下一步的工作重点将是对表达载体的优化与改进，进一步提高产量。 本次研究通过基因工程的手段构建碱性磷酸酶基因的表达载体，对商业化碱性磷酸酶的制备具有重要意义，具有较为重要的科研和经济价值。 1实验材料 1.1试剂 LB?培养基，?氨苄青霉素储存液，?无菌ddwater， DNA分子量标准?DNA HindIII 23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130 bp），电泳级琼脂糖粉，50?X?TAE电泳缓冲液，10X电泳加样缓冲液， 1.2仪器 台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，气浴振荡摇床，制冰机，超净工作台，微波炉和电磁炉，电泳仪和电泳槽，电子分析天平，恒温水浴锅，紫外分光光度计，PCR仪，三用紫外分析仪，恒温细菌培养箱，凝胶成像仪，高压蒸汽灭菌锅。 1.3试验用具 超净工作台，玻璃涂布棒，酒精灯，双面微量离心管架，试管架，记号笔，手表，摇菌试管，1.5mL离心管，0.5mL微量离心管，枪头（0～10uL，20～200uL，200～1000uL），100mL三角瓶，250mL?三角瓶，凝胶成像系统，一次性薄膜手套等,0.2mLPCR微量管，泡沫塑料保温盒，培养皿，琼脂糖凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块,?垂直电泳槽及配套的玻璃板、夹子、密封条、梳子。 1.4菌种 pET-his质粒载体菌， pET-44a-BAP载体菌，E. coli DH5α，E. coli BL21（DE3） 1.5质粒 表达载体pET-His长度: 2.9kb 基因克隆表达功能区详细序列如下： XbaI tctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagc