分子生物学研究方法(下)解析.pdf

第六章 分子生物学研究法（下） ——基因功能研究技术 基因功能的研究思路主要包括: 1. 基因的亚细胞定位和时空表达谱; 2. 基因在转录水平的调控； 3. 细胞生化水平的功能研究：对该基因的表达产物 做一个细胞信号转导通路的定位； 4. gain-of-function loss-of-function: 分别在细胞和 个体水平，做该基因的超表达和敲除，从表型分析 该基因的功能。 功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次 研究，综合分析。 本章内容 基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术 6.1 基因表达研究技术 6.1.1 基因表达系列分析技术 6.1.2 RNA的选择性剪接技术 6.1.3 原位杂交技术 6.1.4 基因定点突变技术 6.1.1 基因表达系列分析技术 基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）是1995年由Velculescu 等建立的技术，在整体水平上对细胞或者组织中 的大量转录本同时进行定量分析，而无论其是否 为已知基因。 概念： 以DNA测定为基础定量分析全基因组表达 模式的技术，能直接读出任何一种细胞类型或组 织的基因表达信息。 原理： 根据理论上任何长度超过9～10(49=262144)个 碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列 （转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分离 转录产物中这些代表基因特异性9～10个碱基的核 苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克隆 和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应 编码基因的表达频率。 步骤: 提取总RNA 以与生物素相连的寡聚dT为 引物，逆转录合成cDNA 识别4bp碱基的锚定酶 （AE ）进行酶切 分离与抗生物素微磁球相 连的3 ′端cDNA 3 ′端cDNA分两份 分别与连接子1和连接子2连接 标签酶（TE ）切割 含有9 －14个碱基的标签 DNA聚合酶(Klenow)补平 标签1 标签2 8 标签1 标签2 连接酶连接 双标签(ditag) 根据连接子1和2 的序列 设计引物进行PCR扩增 电泳回收目的条带 锚定酶（AE ）切掉接头 串联入载体进行表 达频率的分析 Long SAGE技术: 标签来自转录物3’端一段21bp 的序列，可以 进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理 与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标 签酶（MmeI ），并将程序做了相应修改。 6.1.2 RNA选择性剪切 概念 指用不同的剪接方式（选择不同的 剪接位点组合）从一个mRNA前体产生不 同的mRNA剪接异构体的过程。 分类: 外显子遗漏 相互排斥剪切 5’选择性剪切 3’选择性剪切 平衡剪切 步骤: 提取不同组织的总RNA 分离mRNA