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基本原则的实时定量PCRManit得来,伊克巴尔S Shergill级,Magali威廉姆森,林德Gommersall,帕特和Hitendra Neehar RH的等级 实时定量PCR允许敏感的,具体的定量分析、重现性好 核酸分子。自从它实时定量PCR的介绍,已经颠覆了传统的领域 分子诊断技术和技术被用于一个迅速扩张的数量的 应用。 这篇文章回顾了 实时PCR基本原理,多种不同化学物质: 这SYBR?双链的DNA-intercalating剂的研究情况、水解过程进行了探讨,并就绿色1、双杂交探针,分子灯塔和蝎子探头。 定量分析方法 讨论了除了竞争的工具在市场上。的例子 应用这一重要和最多才多艺的技术被提供在复习。 专家破产法组分。核。 在PCR放大检测出。PCR反应生成份DNA模板指数。这一结果在定量开始的数量关系 目标序列的金额与PCR产物 在任何特定的周期积累。由于 发现的多聚酶反应抑制剂 模板、化学试剂的限制或积累钠分子的, PCR反应最终停止产生的效益 在以指数速率模板(例如,高原相位)作出定量的终点 PCR技术的产品不可靠的。因此,复制 反应可以生成不同量PCR技术的产品。只有在这个指数 PCR反应阶段它是可能的为了确定外推回来的 起始数量的模板序列。 他们测量PCR产物积累(即实时定量PCR)允许在指数相定量的 反应,因此消除变异的发生 与常规PCR相关。自从第一个文件的实时性 PCR[1],它已经被使用了一个不断增加 和多样的数量的应用包括 mRNA表达谱的研究,DNA复制 在数量或病毒基因组的测量 DNAs[2胜7负),allelic歧视截流式合流制[8,9], 表达的分析具体的接头的变体 [13]基因和基因表达在paraffinembedded [14、15]组织和激光捕获 microdissected细胞,辍学,[13]。背景和方法论 实时定量PCR是可靠的 产生的产品检测与测量 在每个周期的PCR的过程, 这是直接成正比的数量了吗 开始之前的模板PCR的过程。 荷兰和同事证明 aquaticus的耐高温酶鲸 (例如,Taq DNA聚合酶)有5个′′为3 exonuclease活动。该集团也显示 app的目标,探索在PCR 核酸酶的活性Taq 5′的聚合酶能 被用来检测放大的targetspecific 产品[20]。一个核苷酸探针, 这被设计为杂交在吗 目标序列,被导入PCR 分析检测。该探头是在它贴上32P 5′ 在它的终结,是nonextendable结束3′ 确保它不能作为底漆。退火 探测器的一股PCR产物 在此过程中,放大产生了 适合核酸外切酶 在放大、5到 3倍。Shergill等级的等级,威廉姆森,Gommersall及·派特 破产法组分210专家。核。5(2),(2005) Taq DNA聚合酶活性(当酵素延长 从上游底漆的境界探测器) 堕落成小碎片探测器能分化 从undegraded探针。这依赖于聚合 确保乳沟只有探测器的发生 目标序列被放大。PCR、app的后 我的理解是:探测器测量,采用薄层色谱法 从独立完整的探针。app碎片 fluorogenic dual-labeled寡核苷酸的引入 允许post-PCR探针的消除处理 分析探头的退化[21]。探测器已经是个记者 萤光染料在5′一端是quencher染料附着在 3′结束。当探头是完整的,离的很近的 quencher大大降低了荧光发出 记者染料。发射荧光信号只是在暴露 探测器的,基于荧光共振能量 转移(烦恼)原理[22]。在实时定量TaqMan?一fluorogenic化验 TaqMan nonextendable探针用于(图1)(23)。探测器 荧光染料有记者在它5′一端是 quencher染料在其3′列车的终点站。如果目标序列 现在,fluorogenic探针如果下游之一 本册站点和裂解核酸酶的活性的5′ Taq聚合酶的酶在扩展阶段的 PCR。当探头是完整的,烦恼会发生的原因,了荧光 排放记者染料吸收淬火 染料。通过Taq解理探测器的聚合酶在PCR分开 记者和quencher染料,从而增加了 荧光从前者。此外,app移除 钢绞线的探头从目标,允许底漆延伸到 坚持到底的模版,从而没有扰乱 与指数累积的PCR产物。另外 记者染料分子从他们的各自的裂解 探针在每个周期的增加,导致荧光 强度成正比的数量的amplicon产生了。 各种各样的可用于实时PCR是化学反应 随后描写进行综述。使用任何发达的化学成分分析,增加的荧光 在PCR反应排放中可检测到 通过一种改进的thermocycler实时。计算机软件的 情节建构使用荧光光谱放大 中收集的数据,这些数据PCR扩增(图2)。 图2显示一个代表放大情节和 定义了与之相关的重要条件。 底线