肺炎克雷伯氏菌的蛋白质组学分析.pdfVIP

目 录 摘 要 1 前 言 6 材料与方法 9 1 实验材料 9 1.1 标准菌株 9 1.2 实验菌株 9 1.3 主要试剂来源 9 1.4 主要试剂配制 10 1.5 主要实验器材 10 1.6 药敏纸片 11 2 实验方法 11 2.1 ESBLs 仪器初筛实验 11 2.2 产ESBLs 菌株表型确证实验 11 2.3 细菌保存 12 2.4 细菌复苏 12 2.5 细菌蛋白提取 13 2.6 细菌蛋白保存 13 2.7 制备样品混合液 13 2.8 芯片活化 13 2.9 上样 14 2.10 质量控制 14 3 质谱检测 14 3.1 检测标准化 14 3.2 质谱仪检测样本 14 2 4 数据采集 16 5 数据分析 16 5.1 ESBLs 菌株的蛋白质决策树诊断模型的建立 16 5.2 细菌蛋白质组学同源性分析 17 结 果 18 1 产ESBLs 表型确证试验 18 2 肺炎克雷伯氏菌蛋白质指纹图 19 3 肺炎克雷伯氏菌产ESBLs 菌蛋白决策树诊断模型 21 4 聚类分析 24 4.1 聚类方法 24 4.2 32 株产ESBLs 细菌聚类分析结果 26 4.3 49 株肺炎克雷伯氏菌聚类分析结果 27 讨 论 31 1 ESBLs 菌株检测方法及产ESBLs 细菌的防治 31 2 细菌同源性分析的方法 32 3 蛋白组学鉴定细菌感染的同源性 34 结 论 36 致谢 41 缩略语名词对照 42 综述 44 3 肺炎克雷伯氏菌的蛋白质组学分析 摘 要 目的：利用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 （SELDI-TOF-MS ）检测临床感染的肺炎克雷伯氏菌蛋白质谱，对所得质 谱数据进行决策树诊断和聚类分析，为肺炎克雷伯氏菌产超广谱β- 内酰胺 酶（ESBLs ）菌株的鉴定和细菌同源性分析寻求简便快速的实验方法。 方法：1. ESBLs 仪器初筛实验 （screening test ）：使用walkaway-96 全 自动细菌药敏鉴定仪对临床分离的肺炎克雷伯氏菌进行 20 种常见抗生素 敏感实验，凡头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟中有三 种或三种以上显示耐药，仪器提示这些细菌为产ESBLs 可疑菌株，应进一 步做ESBLs 确证实验。2. ESBLs 表型确证实验(confirmatory test) ：对初筛 可疑产ESBLs 菌株采用抗菌药物头孢他啶/克拉维酸（30μg /10μg ）与头孢 他啶抑菌圈差值，头孢噻肟/ 克拉维酸（30μg/10μg ）与头孢噻肟抑菌圈直 径差值来判断,当二种抗菌素中任何一种加克拉维酸后抑菌圈直径与不加 克拉维酸的抑菌圈相比，增大值≥5mm 时，判定为ESBLs 阳性。以上两种 试验均用肺炎克雷伯氏菌 ATCC700603 做质量控制。3.细菌蛋白质谱分析 对确证产ESBLs 的菌株和不产ESBLs 的肺炎克雷伯氏菌通过先破坏细菌、 提取蛋白质，再用SELDI-TOF-MS 技术及Au 蛋白芯片自动检测细菌蛋白 质指纹图谱。4.数据分析 对检测的细菌蛋白质图谱用Biomarker Wizard 3.1 软件进行分析，筛选肺炎克雷伯氏菌 ESBLs 阳性菌株和ESBLs 阴性菌株 相关差异表达蛋白，建立肺炎克雷伯氏菌 ESBLs 阳性菌株决策树诊断模 型；用SPSS 对肺炎克雷伯氏菌进行聚类分析，追溯其临床感染的同源性。 1 结果：1.对walkaway-96 仪器初筛产ESBLs 的33 株肺炎克雷伯氏菌通 过纸片法表型确证实验确证有32 株细菌ESBLs 阳性 （准确率为96.97% ）， 这些ESBLs 阳性菌株主要分离自