Necl家族蛋白胞外区表达纯化和胞内区相互作用蛋白筛查.pdfVIP

北京协和医学院硕l：研究生论文 摘 要 家族成员，都是Ca2+非依赖性的细胞黏附分子，这些分子间存在着广泛的同源或异源 的相互作用。Necl家族分子是神经系统特异表达或高表达的，通过同源或异源的相 互作用在细胞粘附、突触形成、髓鞘发生等过程中起着重要的作用。已有研究表明， 外周神经系统中Necl1与Necl4间的相互作用对于施旺细胞形成髓鞘十分重要。而 Necl2是一个肿瘤抑制因子并且可以调节突触的形成。Necl家族分子间广泛的相互作 用正是其功能所必需的，而这种作用是由胞外区介导的并与其糖基化形式相关。在本 实验室的前期工作中，我们解析了Necll胞外区第一个Vdomain的三级结构，发现 Necll胞外区第72位的苯丙氨酸对其形成二聚体很重要。另有实验室报道了Necl5 的前两个结构域的晶体结构以及其与脊髓灰质炎病毒相互作用的位点。 选用了Bac-to—Bac杆状病毒表达系统，这是一种通过位点特异的转座作用产生用于表 达的重组杆状病毒的系统。从成年小鼠脑的cDNA中克隆出四种基因的编码区，并将 于表达的重组杆状病毒。我们用低MOI值的P1代重组杆状病毒感染Sf9细胞，扩增 表达所需的病毒，并用实时定量PCR的方法测定病毒的滴度。 为了确定表达目的蛋白的最适宜条件，我们进行了一系列的实验。首先，将带有 不同信号肽以及野生型和糖基化位点突变型的Necll的重组病毒感染昆虫细胞，检测 不同的信号肽序列对外源蛋白的分泌量的影响，以及外源蛋白Necll自身的糖基化位 点对表达后修饰的影响。结果表明，实验中所选用的分别带两种信号肽的外源蛋白的 分泌无明显差异，而Necll蛋白不存在糖基化修饰。然后，比较了在相同感染条件下， Sf9和S亿l两种细胞株的外源蛋白表达量是否存在差异。第三，采用两种培养基及6 种血清浓度进行外源蛋白的表达，优化培养条件。第四，分别用不同MOI值的病毒 感染Sf2l细胞，确定用于感染的MOI值。第五，每24小时收取一次培养基上清， 检测外源蛋白分泌量与时间的关系。最终确定了外源蛋白的最适表达条件为S亿1细 insect 胞株、Grace’S 时间，并应用此条件成功表达了四种蛋白。之后，我们用Ni柱对少量表达的外源蛋 !!室垫塑垦兰堕堡主竺壅竺丝茎 白进行初步纯化，并用不同浓度的咪唑进行洗脱，最后选择50mmol／L的咪唑浓度作 为洗脱条件，获得了较高纯度的Necl4蛋白胞外区产物。 Necl家族蛋白通过胞内区与细胞内信号通路发生作用。为了进一步研究Necll 蛋白的作用机制，我们利用酵母双杂交系统筛选与Necll胞内区相互作用的蛋白。构 cDNA文库进行酵母双杂交筛选。酵母双杂交阳性克隆经测序后显示共存在9段不同 序列(存在重复克隆)。比对氨基酸序列得到5个可能的相互作用蛋白。并通过GST down实验验证了其中两个蛋白与Necll胞内区的相互作用。 pull 关键词：Necl，蛋白表达，昆虫表达系统，酵母双杂交筛选 2 北京协和医学院硕仁研究生论文 Abstract as knownCADMor are Nectin-like(Necl，also five members．Thereare members，Necll，Necl2， immunoglobulin(Ig)-likesuperfamily Necl5．Eachoftheseincludesaextracellular three Necl3，Necl4，and regioncomposedby transmembrane short domains，a