家蚕30K蛋白LP7的分离纯化及功能初探 毕业论文.docVIP

硕士学位论文 家蚕30K蛋白LP7的分离纯化及功能初探 特种经济动物饲养专业硕士研究生 摘 要 家蚕30K蛋白是在家蚕血液中大量表达的一类低分子量脂蛋白，也是桑蚕特有的一类蛋白质。该类蛋白由脂肪体合成，并分泌到血液中，它们是家蚕生长发育过程中的主要存储蛋白之一，也是家蚕胚胎发育的重要能源物质。30K蛋白成员众多，其氨基酸序列同源性较高，因此对这类蛋白进行分离纯化较为困难。目前，已经分离纯化出的30K蛋白只有4种。家蚕基因组框架图的完成为我们提供了大量的数据资源，利用这些数据预测到10个30K蛋白基因，这些基因所编码的氨基酸数目在246-271个之间，理论等电点在6.1-8.4之间，分子量在28-31kD之间，它们的氨基酸序列同源性都在60%以上。本研究通过分析各类30K蛋白的理论等电点和分子量，设计并开展了30K蛋白的纯化工作，获得了一种新的30K蛋白，在此基础上对该蛋白进行了相关的分析和研究，主要结果如下： 本研究首先参考了10个30K蛋白的理论分子量和等电点，设计了分离纯化的实验流程和实验条件。通过硫酸铵沉淀和三种层析分离技术（阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析），对家蚕血液蛋白质进行分离纯化，最终获得一种30K蛋白。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）检测，所获得的蛋白样品信号峰单一。同时，通过MALDI-TOF-MS获得该蛋白的肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)，利用GPMAW（General Protein/Mass Analysis for Windows）软件搜索家蚕蛋白质理论数据库，该蛋白被鉴定为30K蛋白基因Bmlp7编码的蛋白LP7，且其序列与已报道的所有30K蛋白序列均有较大差异。 利用多克隆抗体制备技术，将分离纯化获得的30K蛋白LP7作为抗原，采取多次皮下注射的方法对家兔进行免疫，颈动脉放血法采集血液，获得其抗血清。通过饱和硫酸铵沉淀法粗提抗血清中的抗体，去掉了大量杂质和部分杂蛋白，最后获得了抗30K蛋白LP7的抗体粗品，达到下一步实验的要求。 通过Western blot技术，分别对家蚕5龄起、5龄第3天和羽化第3天的各个组织器官进行检测。结果发现，5龄起时，只在血液中检测到LP7；5龄3天时，血液中的LP7杂交信号强度明显增加，此外，在头、脂肪体和生殖腺中均检测到LP7，体壁和中肠中也有少量LP7存在，而丝腺和马氏管中没有检测到任何杂交信号。同时，分析家蚕5龄3天组织芯片数据，结果表明Bmlp7基因在头、脂肪体、体壁和生殖腺中表达，其中头的表达量最高，在丝腺和马氏管中只有微量表达，而在中肠和血液中没有表达。因此，我们推测5龄第3天血液中增加的LP7蛋白是由脂肪体中合成后转移而来的；中肠的微量LP7可能从血液中转移而来；丝腺和马氏管中Bmlp7基因的表达量较低，导致蛋白水平上检测不到。对羽化第3天的组织器官进行检测，发现所有组织中均存在LP7，但此时该蛋白在雌性生殖腺中的信号强度远远高于其他组织。LP7蛋白在家蚕大量组织器官中的广泛存在，暗示该蛋白在家蚕的生长发育过程中起着非常重要的作用。 同时，利用Western blot技术对家蚕部分时期的血液与生殖腺进行对比分析。发现在血液中，从5龄第3天开始检测到明显LP7杂交信号，并且随着生长发育的进行其强度逐渐增加，到化蛹第1天达到最大值，而后逐渐降低，羽化第3天时杂交信号已非常微弱；而在生殖腺中，5龄第3天的LP7杂交信号非常微弱，而后逐渐增加，蛾期达到最大值。这一结果表明生殖腺中的LP7蛋白可能是由血液中转移而来，并参与了卵母细胞的形成，推测该蛋白在家蚕胚胎发育过程中起着一定作用，可能是胚胎发育的重要能源物质。检测化蛹第6天的雌雄生殖腺，结果显示雌雄生殖腺中均存在LP7，表明该蛋白在家蚕生殖发育过程中具有重要作用。进一步分析家蚕芯片时期表达谱，结果表明30K蛋白基因Bmlp7的表达量从5龄后期急速增加，吐丝前后达到最大，此后急剧下降，从上簇后的一段时间到化蛹4天，其表达又有缓慢上升的趋势，化蛹5天后表达量有所降低，到化蛾时又上升。而已有的研究报道表明该基因在脂肪体中的表达只持续到化蛹第5天。因此，推测30K蛋白LP7从血液转移到生殖腺的同时，其他组织中也可能合成该蛋白。 此外，利用玻璃毛细管注射器，将黑曲霉菌（一种真菌）注射到化蛹3天的蚕蛹体内，分别提取注射24h和48h后的血液，通过Western blot技术检测血液中30K蛋白LP7的变化情况。发现在注射黑曲霉菌的家蚕蛹期血液中，L