免疫学技术在科研中的应用详解.ppt

————————————————————————————— 固有免疫 适应性免疫 ————————————————————————————— 细胞组成 粘膜和上皮细胞、 T淋巴细胞、B淋巴细胞、 吞噬细胞、 NK细胞、 抗原提呈细胞 NK1.1+T细胞、γδT细胞 B-1细胞 产生 先天具有 后天经抗原刺激而获得 作用时效 即刻～96小时内 96小时后 作用特点 非特异性 特异性 无增殖分化，作用迅速 特异性细胞克隆增殖、分化 无免疫记忆 有免疫记忆 作用时间 作用时间短 作用时间长 ————————————————————————————— 细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反应（agglutination）是最经典的免疫学检测技术。 免疫标记技术= 基本原理 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。 基本特点 ① 标记后保留酶和抗原(抗体)的活性； ② 酶促反应专一性，保证特异性； ③ 底物反应放大作用，提高敏感性。 ④ 酶标试剂保存稳定； ⑤ 操作简便、安全易行。 酶免疫组化 用于检测组织切片或细胞涂片中 酶免疫技术 的抗原或抗体检测 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定 （ELISA） 液相酶免疫测定 （一）固相载体 基本要求 结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。 种类与选择 1.塑料制品 2.微颗粒 3.膜载体 1.用于标记酶的要求： 酶活性高 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性 酶催化底物后信号易判定或测定 酶活性不受样品中其他成分的影响 酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉 2. 常用酶及其底物 （1）辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase ，HRP） 常用底物： 邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性。 四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。 （2） 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP） 常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。 * AP稳定性及灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，酶标记物 回收率低，且价高，故应用不如HRP普及。 （三）酶标记抗体或抗原 基本要求： 酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；抗体的特异性好，效价高，亲和力强，比活性高以及易于批量生产和分离纯化。 酶标记方法 1.交联法 以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法。 2.直接法 用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）标记物制备。 （四）标记抗体鉴定 （五）免疫吸附剂 （六）试剂最佳工作浓度的选择 (一)基本原理： 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成） 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应） 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离） 加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 （显色反应） ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物 特点： 非竞争结合反应 常用于抗原的检测（Cytokines Determination） 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分