分子克隆技术实验操作手册2005要点.doc

分子克隆技术 实验操作手册2005 生命科学技术学院 课程简介 分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆和分子杂交两大部分： 分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。 分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting等。Southern blotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经X-光片自显影显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。为让学生初步了解有关RNA的操作过程注意事项，我们还列出Northern blotting的操作步骤以供选择。 目 录 系列一 分子克隆技术 4 实验一 质粒的制备 4 实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳 5 实验三 外源DNA片段在质粒载体中的克隆 7 实验四 感受态细胞的制备 9 CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 9 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 10 实验五 质粒的转化及转化子的鉴定 11 热激法转化实验步骤： 11 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 12 实验六 PCR技术 12 系列二 Southern杂交技术 14 实验一 植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法） 14 实验二 总DNA质量检测及酶切 15 实验三 电泳、转膜 16 实验四 Southern Blotting 18 系列三 Northern Blotting 24 实验一 RNA Extraction (mini prep) 24 实验二 RT-PCR (Reverse transcription PCR) 26 实验三 RNA的电泳，转膜和杂交 28 附录 试剂配方 29 一 细菌培养试剂 30 二 质粒抽提试剂 30 三 DNA操作试剂 31 四 RNA操作试剂 34 Stock Solution: 34 Work Solution 35  系列一 分子克隆技术 实验一 质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。 实验原理：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 实验步骤： 取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养； 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜培养； 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 加入300 (l溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 加入300 (l溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟； 加入300 (l溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀； 12000 g离心10分钟； 吸取8