majun基因工程工具酶.ppt

大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ） 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ（DNApolⅡ） 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ（DNApolⅢ） Klenow片段 T4-DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶 Taq DNA 聚合酶 pfu DNA 聚合酶 1、5`?3`聚合酶活性：以DNA为模版，在dNTP和镁离子的存在下，催化单核苷酸结合到引物分子的3`-OH末端，沿5`?3`方向合成DNA。 2、5`?3`外切酶活性：可以从5`端降解双链DNA，使之成为单核苷酸，也可降解DNA:RNA杂交体中的RNA成份，即拥有RNA酶H活性。需要5`端游离的磷酸基团 3、3`?5`外切酶活性：从3`-OH末端降解单链或双链DNA分子，降解产物为单核苷酸，当有dNTP存在时， 5`?3`聚合酶活性抑制3`?5`外切酶活性。 DNA polI具有3种酶活性，在基因工程中常用作制备探针。 用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶I为两个蛋白质片段，其中较小的片段具有5`?3`外切酶活性，较大的片段具有5`?3`聚合酶和3`?5`外切酶活性，称为Klenow片段。 Klenow片段的功能： 1、补平粘性末端 2、标记末端 3、合成cDNA第二链 4、用于Sanger双脱氧末端终止法的DNA序列分析 5、合成杂交探针 常用功能 DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApolⅠ不是DNA复制的主要聚合酶。1970年发现了DNApolⅡ。此酶MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。 DNApolⅡ的功能： ⑴聚合作用：该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。 该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙（gap）的单链DNA部分，而且该单链空隙部分不长于100个核苷酸。 ⑵该酶也具有3→5外切酶活性，但无5→3外切酶活性。 ⑶该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2-脱氧核苷酸掺入到DNA链中。 ⑷该酶不是复制的主要聚合酶，可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。 DNA polⅢ也有3→5和5→3外切酶活性，但是3→5外切酶活性的最适底物是单链是DNA，只产生5-单核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从3端开始切除一个核苷酸。 5→3外切酶活性也要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。 DNA polⅢ是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该酶的温度突变株在限制温度（non permissive temperature）内是不能生长的，此种突变株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶Ⅲ则可以恢复其合成DNA的能力。 T4 DNA聚合酶与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ相似，也是一条多肽链，分子量亦相近，但氨基酸组成不同，它至少含有15个半胱氨酸残基。 T4 DNA聚合酶的作用与大肠杆菌DNA polI不同 [1]它无5→3外切酶活性 [2]它需要一条有引物的单链DNA作模板 [3]它利用单链DNA为模板，也可同时利用它作为引物，3端的未杂交部分即被T4 DNA聚合酶的3→5外切酶活性切去，然后在其作用下从3-OH端开始聚合，合成该模板DNA的互补链，再以互补链为模板合成原来的单链DNA。 分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃， 对95℃高温具良好稳定性，该酶具有5‘→ 3外切酶活性，不存在3’→5’外切酶活性。 TaqDNA聚合酶还要具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链3加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3突出的单A核苷酸尾； 在仅有dTTP存在时，它可将平端的质粒的3端加入单T核苷酸尾，产生3端突出的单T核苷酸尾。应用这一特性，可实现PCR产物的T-A克隆法。 从高温嗜热菌（Pyrococcus furiosis）中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有5-3外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低。PCR产物为平端，无3端突出的单A核苷酸。 核糖核酸酶(Ribonuclease, Rnase)是一类催化RNA降解为小片段的核酸酶。 在所有已研究的有机体中都含有大量不同类型的核糖核酸酶，表明RNA降解是一个非常原始而且重要的过程。 除了帮助清除细胞内不再需要的RNA，RNase同时也参与了所有RNA分子的成熟过程，其中既包含了携带遗传物质用于指导蛋白质合成的信使RNA，也包含了细胞内功能多样的各种非编码RNA。 核糖核酸酶可划分为核糖核酸内切酶（endoribonucleases）和核糖核酸外切酶（exoribonucleases）。在生物科研的日常应用中，RNaseA和RNaseH是两类最常见的核糖核酸酶，两者同属于核糖核酸内切酶亚类。 RNase H：是核糖核酸内切酶，它能