03.生物技术药物的制造进程.ppt

二、生物技术药物的物理稳定性 1、变性作用 凡能影响蛋白质分子二、三、四级结构稳定性的因素均可导致蛋白质变性，如温度（加热）、pH、光照、超声波处理、高频振荡、有机溶剂和变性剂等。变性作用有可逆的，也有不可逆的，变性蛋白质降低了水溶性，改变了三维结构，增加了对蛋白酶的水解敏感性，导致了天然蛋白生物活性的降低与丧失。 * 2、表面吸附（电荷 和水层） 表面吸附作用对某些蛋白质具有强力破坏作用，如胰岛素会在玻璃表面、塑料容器和试管壁上沉淀出来，也会在静注塑料袋内表面和输液泵内表面沉淀出来。如rIL-2在进行灌注时会吸附在管道表面，造成活性损失。非离子型表面活性剂如“TWeens” 表面活性剂也用于稳定蛋白质溶液，可以防止蛋白质在物体表面的吸附作用，这可能是通过与蛋白质分子周围的水分子相互作用。 3、共价自身凝聚 在多肽变性过程中，蛋白质的折叠与去折叠首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成可溶性和不溶性聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。聚集体减少了蛋白质活性，改变了免疫原性。 疏水相互作用是形成聚集体的主要驱动力。发生聚集作用的蛋白质主要发生大小的变化和沉淀形成。　　 * 三、提高生物技术药物稳定性的途径 1、定点突变 通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。2、化学修饰 多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。　　 * 3、添加剂 通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween，能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。4、冻干 多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。 * 2、哺乳动物细胞 A优点： 哺乳动物细胞可将表达产物由重组转化细胞分泌到培养液中，使产物易于纯化。 哺乳动物细胞分泌的表达产物是糖基化的，接近或类似天然产物。可获得结构与天然蛋白相一致的活性蛋白，对于制造结构复杂的生物药物是其它系统所无法比拟的。 B缺点： 细胞生长缓慢、生产效率低、培养条件苛刻、费用高，培养液中产物浓度稀，因此生产成本高，扩大生产规模有较大困难。 常用的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵细胞(CHO细胞)和幼仓鼠肾细胞(BHK) * 表达体系 产物 产生部位 培养方式 提纯 产物活性 潜在危险性 大肠杆菌 多肽、蛋白质 或融合蛋白质 菌体内 容易 部分可获高产 一般 对原核者好 真核者稍差 不大 酵母 多肽、蛋白质 或糖基化蛋白 菌体内或分泌出细胞 容易 可高产 菌体内稍 复杂 真核的接近 天然 不大 哺乳动物细胞 完整 糖基化蛋白 分泌出细胞 较难、成本高 可高产 简单 几乎可为天然产物 需注意有致癌因素 * 考虑事项 大肠杆菌 酵母 哺乳细胞 ＤＮＡ的大小和特点 4.6Mb，环形ＤＮＡ 12.1Mb，染色体ＤＮＡ 2000-3000Mb，染色体ＤＮＡ 翻译后修饰 没有 可能，但不同于人 可能，类似或同人一样 生长率（每小时循环数） 3.33/h 0.25/h 0.02/h 培养方法 发酵 发酵 发酵（悬浮细胞） 转瓶（粘附细胞） 成本 低 中间 100万美元／kg 在制药规模上选择宿主细胞用于重组药物的表达中一些关键事项的比较 * 3昆虫细胞表达系统 昆虫细胞可进行信号肽的切除，糖基化等蛋白质翻译后加工，并能进行适当的细胞分区和胞外分泌表达。主要包括杆状病毒表达系统、稳定转化系统（stable transformation system）两种。 杆状病毒表达系统 将目的基因克隆至带有编码杆状病毒多角体或P10启动子的转染载体上，获得重组杆状病毒，感染昆虫细胞［sf-9，sf-2］，BTI-ΤΝ-5Β1-4（High FiveTM）］进行表达。该系统表达的抗体尽管每个细胞的表达水平是原核细胞的50～100倍，但仍为可溶性。另外，杆状病毒有严格的宿主传导性，增加了该系统的安全性。 稳定转化系统 克服了病毒感染引起细胞死亡的缺点，Mahiouz等将抗E-选择素的单链抗体基因克隆于果蝇金属硫蛋白启动子下，转染果蝇细胞，筛选稳定转化的细胞克隆，培养上清中抗体含量达到0.2～0.4mg/L。 * 4、转基因动物