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免疫分析法检测真菌毒素 　　【摘要】检测谷物中常见的真菌毒素。使用酶联免疫分析法检测黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮。黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮ELISA检测试剂盒的标准曲线的IC50分别为0.14，20.4，0.58 ng/mL。上述三种真菌毒素的添加浓度分别为5，500，25 ng/g，平均添加回收率分别为89.2%，94.8%，83.6%。该方法操作简便，准确性好，满足国家限量标准的要求。 中国论文网 /8/view-7248943.htm 　　【关键词】免疫分析黄曲霉毒素B1呕吐毒素玉米赤霉烯酮 　　引言 　　真菌毒素是是由微生物产生的毒素及毒素代谢产物，对人类健康能够产生严重危害。常见的真菌毒素有黄曲霉毒素，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮等。 　　黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强[1]。呕吐毒素（Vomitoxin）又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），具有很高的细胞毒素及免疫抑制性质，对人类和动物都有很大危害，可以导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、头晕、腹痛等急性中毒症状[2]。玉米赤霉烯酮为2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，具有很强的雌性激素作用，可引起动物的雌激素过多症和严重的生殖道症状及不孕症，还具有免疫毒性、肝毒性等，对肿瘤发生也有一定作用[3]。 　　因此，国家对真菌毒素制定了严格的限量标准，我国规定黄曲霉毒素B1在玉米及其制品中不得超过20 μg/kg，在大米等谷物中不得超过10 μg/kg，在小麦等谷物中不得超过5 μg/kg，脱氧雪腐镰刀菌烯醇在谷物及其制品中不得超过1000 μg/kg，玉米赤霉烯酮在谷物及其制品中不得超过60 μg/kg[4]。 　　酶联免疫分析法检测真菌毒素具有灵敏度高，检测时间短，操作简便，能够批量检测，便于现场大量样品快速筛查等优势。 本研究建立一种酶联免疫分析法，用于检测黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮，方法简便，准确度高，为进一步研究生物毒素的快速检测方法奠定了基础。 　　1 材料与设备 　　1.1 试剂与材料 　　黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒，呕吐毒素ELISA检测试剂盒，与玉米赤霉烯酮ELISA检测试剂盒，来自北京普析通用仪器有限责任公司。其他化学试剂购于西陇化工股份有限公司。 　　1.2 设备 　　酶标仪，北京普析通用仪器有限责任公司。 　　2 方法 　　2.1 前处理步骤 　　（1）将玉米样品粉碎，称取5.0 ± 0.05 g 粉碎后的样品；（2）加入25 mL 60% 甲醇，剧烈振荡 10 min；（3）4000 r/min，离心5 min；（4）取1 mL上清液，用4 mL样品稀释液进行稀释，混匀；（5）待测。 　　2.2 ELISA操作步骤 　　（1）加样：每孔依次加入样品，酶标物工作液，与抗体工作液，各50 μL；（2）孵育：室温孵育30 min；之后，用洗涤液洗涤五次。（3）显色：每孔加入显色液A与显色液B各50 μL，室温避光作用15 min。（4）每孔加入50 μL终止液，用酶标仪检测其450 nm处的OD值[5]。 　　2.3 添加回收率计算 　　在玉米样品中添加适当浓度的黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，或玉米赤霉烯酮，按照2.1的步骤进行前处理，之后按照2.2的步骤检测，每个样品检测4次，计算添加回收率与平均值。添加回收率的计算方法：添加回收率 = （样品检测浓度 ?C 空白样品检测浓度）/ 添加浓度×100%。 　　3 结果 　　3.1 标准曲线 　　黄曲霉毒素B1的ELISA标准曲线见图1。由图1可知，黄曲霉毒素B1的IC50为0.14 ng/mL。 　　呕吐毒素的ELISA标准曲线见图2。由图2可知，呕吐毒素的IC50为20.4 ng/mL。 　　玉米赤霉烯酮的ELISA标准曲线见图3。由图3可知，玉米赤霉烯酮的IC50为0.583 ng/mL。 　　3.2 添加回收率 　　玉米中黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，或玉米赤霉烯酮的添加回收率见表1，由表1可知，在玉米中添加5 ng/g黄曲霉毒素B1，平均添加回收率为89.2%，添加500 ng/g呕吐毒素，平均添加回收率为94.8%，添加25 ng/g玉米赤霉烯酮，平均回收率为83.6%，结果的准确性较好。 　　4 讨论 　　本研究采用酶联免疫分析法检测黄曲霉毒素B1，呕吐毒素，或玉米赤霉烯酮，平均添加回收率在80%到100%之间，准确性较好，可以满足国家限量标准[4]。本研究为开发检测真菌毒素的蛋白质芯片及方法奠定了基础。 　　蛋白质芯片的技术原理是，将各种蛋白质有序地固定于芯片基