糖基转移酶定向进化研究进展 毕业论文.doc

糖基转移酶定向进化研究进展 摘　要：糖基转移酶在改造含糖活性化合物以获得结构多样性过程中起着重要作用，定向进化不仅能够提高其对底物的宽泛性，同时也能够提高其催化活性。定向进化的成功与否取决于突变体库的多样性及筛选方法的可靠性和效率。本文简要综述了糖基转移酶随机突变方法及高通量筛选正突变体的策略，包括基于细胞的筛选法、基于荧光受体高通量筛选和p H 值指示计高通量筛选。 关键词：糖基转移酶；定向进化；高通量筛选 在自然界中存在的许多含糖小分子物质(糖苷类化合物) 具有生物活性，在目前临床应用的药物中，很多都来自这类小分子物质。而这些小分子结构中的糖基的多样性和在分子中的不同位置，往往对这类化合物的生物活性是至关重要的。改造糖分子的结构，使其具有生物活性、药用价值，这为含糖药物筛选工作提供了一条重要途径。 糖基转移酶(glycosyltransferase, GTs) 参与糖苷类化合物生物合成，是对糖分子进行生物学方法改造的重要对象[1] (表1)。GTs催化不同的糖基与特定的受体分子结合，从而产生大量的寡糖、多聚糖和其他结构多样性的糖苷类化合物。但是，由于糖基转移酶独特的结构和作用机制，决定了该酶具有高度的底物特异性而限制了多样性糖基的转移，以致难以获得结构多样性的糖苷类化合物。因此，提高糖基转移酶催化底物的宽泛性，使它能够将更多种类的糖基引入多种具有重要价值的小分子中，丰富糖苷类药物的多样性，成为研究的重点。 酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略，它主要包含两个基本步骤：(1)建立目的基因的突变体库;(2)对不同突变基因表达的蛋白进行筛选，找到有益突变体。 在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶，这在短期内可以在试管中完成，而在自然界需要几百万年的进化过程，因此，可能是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径。 1 GTs的结构及作用机制 尽管GT 的序列千差万别，但出人意料的是如此众多的家族却只采用了两种相类似的折叠方式——Rossmann卷曲，形成GT-A 和GT-B 两大超家族。GT-A家族中的蛋白由两个紧密相邻的?/?/??折叠构成，而GT-B家族中的蛋白由两个?/?/??结构域彼此相对且自由连接。与GT-A 超家族不同的是GT-B 超家族中没有“D X D ”功能域，“D X D ”是一种具有高度保守性的模体，它的作用是将糖基与另外的糖基、磷酸盐和蛋白结合。先进的分子生物学手段使得越来越多的折叠形式被我们所知，第三种折叠方式GT-C 就是通过BLAST 等迭代序列查找技术 而发现的[17]，其跨膜蛋白的拓扑学结构还没有通过实验来证明。 根据异头碳的立体构型，糖基转移酶分为构型翻转型(inverting)和构型保持型(retaining)。构型翻转型糖基转移酶是通过酶催化激活路易斯酸，使之脱去一份磷酸盐，完成一个类似SN2 亲核取代反应。构型保持型糖基转移酶，被认为符合由Breton等[18]提出的双置换机理，即首先产生糖基- 酶中间复合物, 接着再与受体完成第二步取代反应，但由于一直无法找到对应的糖基- 酶中间复合物，所以其反应机制目前尚属推测。 2 GTs的定向进化 体外定向进化是改造酶的一种有效的新策略，主要是模拟自然进化进程，在一种酶的特定位置引入随机变异，再经由D N A 改组、交错延伸过程、随机引导重组等进行突变基因的体外重组，最终经筛选获得所需活性的酶。 2.1　突变库的构建　 定向进化首先需要构建包含大量突变的基因文库，通常采用随机突变和基因重组的方式来进行。随机突变包括易错PCR(epPCR)和饱和突变(saturationm utation )等；基因重组包括D N A 重组( DNA Shuffling)、渐进式切割产生杂合酶(incremental truncationfor the creation of hybrid enzymes, ITCHY) 、交错延伸法(staggered extension process, StEP)、随机引物体外重组(random-priming in vitro recombination, RPR)、临时模板随机嵌合生长( random chimera genesison transient templates, RACHITT)、外显子改组 (exonshuffling)和酵母增强组合文库(combinatoriallibraries enhanced by recombination in yeast, CLKRY,) 以及随机片段交换法(random insertional-deletional strand exchange mutagenesis, RAISE)[19]等9种方法。构建糖基转移酶突变库最为常用的是易错PCR、饱和突变和DNA 重