CRISPRCas重点分析.pptVIP

局限性： CRISPR/Cas9对目的序列的识别与结合必须有PAM的存在。这就使得该系统对基因组的靶向识别位点被限制在平均每 8 个碱基一个位点。 问题 CRISPR/Cas9 来源于细菌，它是否会对哺乳动物细胞或个体产生毒性或是否会诱发哺乳动物细胞或个体的免疫反应？ CRISPR/Cas系统是依赖ＤＮＡ复制或者转录过程将ＤＮＡ解螺旋还是本身就具有ＤＮＡ解旋能力？ CRISPR/Cas9 系统如何导入受体并保证CRISPR系统的组份能准确地到达 DNA 靶序列？ 如何突破PAM序列的限制、如何建立对Cas9特异性(脱靶效应) 的全面评价体系、如何构建不同物种中可通用的Cas9与sgRNA 导入与表达系统以及如何更有效的激活同源重组修复等。 7 提高打靶特异性的策略 降低sgRNA 与Cas9 的浓度。这一方法的效果还有待讨论。有研究表明该方法可显著降低脱靶突变/打靶突变的比例，但也有研究称该方法将同时降低脱靶突变与打靶突变的发生。 利用Cas9 的切口酶突变体产生DNA单链断裂。因为与DNA 双链断裂相比，DNA 单链断裂将诱导保真性更高的碱基切除修复。 麻省理工学院张峰实验室的一种提高CRISPR/Cas系统特异性的新思路。他们开创性的提出，将突变的只能在双链DNA上形成缺口的Cas9n蛋白（Cas9n为D10A突变的突变体，只能切割与sgRNA直接互