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实验六 不同植物体内多酚氧化酶的酶学性质比较 石陆娥 shilue@126.com 实验目的 1、掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。 2、了解不同来源多酚氧化酶具有不同的最适pH。 实验原理 多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是一种多功能的氧化酶，PPO能催化多酚类氧化成醌类, 醌再聚合成有色物质,从而引起植物的褐变，酶促褐变与果蔬加工密切相关, 因此对于多酚氧化酶的研究有重要的实用价值。PPO专一性不强，在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.)和漆酶(laccase,EC.)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。多酚氧化酶催化的典型反应为： 酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2? 邻醌 ＋ H2O 在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中，PPO是与内囊体M膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后被活化，从而表现出活性。在PPO中，铜是酶的活性中心，失去铜将失去酶活,但不同来源的多酚氧化酶结合的铜离子个数不同。多酚氧化酶的提取方法有丙酮粉法(常规法)、匀浆法、匀浆浸提法。丙酮粉法对PPO酶提取活性损失较大，活性得率较低，但其酶粉活性尚可、体积小和便于贮存，可直接应用；缓冲液匀浆液提取活性得率较高，但酶液本身活性较高，不利于酶的应用，尚需进行浓缩、提纯才能达到应用的要求；采用匀浆法和丙酮粉法二者结合的方法，是一种很好的提酶方法。???????????????????????????????? ? 大部分PPO的活力受其环境pH的影响。PPO的最适pH值因酶的来源、底物的种类和浓度，以及缓冲液成分的不同而不同，因此掌握不同来源PPO的最适pH对食品加工有重要意义。 材料、仪器及试剂 1、材料：马铃薯块茎、苹果、藕等 2、仪器：722型分光光度计；冷冻离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。 3、试剂： 0.1mol/L pH5.0，5.5，6.0， 6.5，7.0，7.5磷酸缓冲液，0.1 mol/L的邻苯二酚（实验当天配置），质量分数为20％的三氯乙酸溶液。 实验步骤 1. 粗酶液的制备 从新鲜马铃薯块茎中提取多酚氧化酶：取预冷新鲜马铃薯洗净去皮后，称取5.0g，切碎，放入研钵中,加入10ml pH6.5的0.1mol/L的预冷的磷酸盐缓冲液，研磨成匀浆，使受伤组织中的多酚氧化酶从细胞中分离出来，过滤，将滤液装入离心管中，滤渣放入研钵中加入继续加入10ml pH6.5的0.1mol/L的预冷磷酸盐缓冲液，研磨过滤，在4℃高速冷冻离心机中以8000r/min离心10min,取出离心后的匀浆液，得到的上清液即为粗酶液A。 从苹果中提取多酚氧化酶：取预冷苹果洗净去皮后，称取5.0g，切碎，放入研钵中,加入10ml pH5.5的0.1mol/L的预冷的磷酸盐缓冲液，研磨成匀浆，过滤，将滤液装入离心管中，滤渣放入研钵中加入继续加入10ml pH5.5的0.1mol/L的预冷磷酸盐缓冲液，研磨过滤，在4℃高速冷冻离心机中以8000r/min离心10min,取出离心后的匀浆液，得到的上清液即为粗酶液B。 从藕中提取多酚氧化酶：取预冷藕洗净去皮后，称取5.0g，切碎，放入研钵中,加入pH7.0的0.1mol/L的预冷的磷酸盐缓冲液，研磨成匀浆，使受伤组织中的多酚氧化酶从细胞中分离出来，过滤，将滤液装入离心管中，滤渣放入研钵中加入继续加入10ml pH7.0的0.1mol/L的预冷磷酸盐缓冲液，研磨过滤，在4℃高速冷冻离心机中以8000r/min离心10min,取出离心后的匀浆液，得到的上清液即为粗酶液C。 2、粗酶液A、B、C最适pH的测定 取16根试管，分别编号对照，A1,A2,A3,A4,A5；B1,B2,B3,B4,B5；C1,C2,C3,C4,C5；均加入1.5ml邻苯二酚溶液（0.1mol/L），然后分别加入2.5ml 0.2mol/L不同pH（5.5,6.0,6.5,7.0,7.5）的磷酸缓冲液,对照中加入煮沸灭活的酶液1ml, A,B或C中分别加入酶液A，B或C 1ml,混匀，室温下保温10min，迅速放入冰浴中，并立即加入2ml预冷的三氯乙酸终止反应，在525nm波长下，