百合土壤农杆菌介导的基因工程育种教案分析.ppt

回顾转基因的整个实验操作流程 参考论文：《农杆菌介导的LFY基因过量表达载体转化百合的研究》 — 华农 中国是百合种类分布最多的国家，百合开花时间上,不同品种差异较大,大多数品种从种子到开花需要2-3年。过长的营养生长阶段己经成为其商业生产的阻碍,且传统的日照,温度等花期调控手段存在费时费力,效果不显著的现象。拟南芥LFY基因参与花分生组织和花器官起始以及花序形态构成。但是LFY基因对于植物由营养生长向生殖生长转化的作用在百合中还未见报道。 研究意义 基本流程 基于以上研究结果我们构建了拟南芥组成型启动子CaMV35S启动的LFY基因过量表达载体，并通过农杆菌介导法转化到百合中。通过潮霉素抗性筛选,PCR检测获得了转化植株,并研究了 基因对其形态发育过程的影响进行了观测统计和数据分析,以期为百合形态和花期调控进一步研究打下基础。 LFY基因的克隆 在已报道的LFY序列基础上以拟南芥cDNA 为模板,设计特异引物扩增1200bp的LFYcDNA全长序列,引物序列如下: LFY-F:AGATCTTATGGATCCTGAAGGTTTCACGAGTG (下划线为 Bgl //限制性内切酶位点) LFY-R: GGTGACCCTAGAAACGCAAGTCGTCGCCGC (下划线为Bst EⅡ限制性内切酶位点)。 1.1 PCR产物检测 扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,PCR产物的电泳图见(图3-4)。电泳结果表明,DNA标准分子量条带相比较,扩增产物的长度与大小与预期的 相吻合,且条带明亮,没有引物 二聚体。初步确定这个 扩增产物为LFY基因片段。 1.2 PCR产物回收、连接克隆载体 用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化,然后将回收的目的片段连接到pGEM-T-easy载体上,连接程序 1.3 蓝白斑筛选克隆载体 将连接后的产物用热激法转化感受态TOP10细胞中,加入150ulLB液体培养基,置于摇床上,37°C,165rpm培养2h取培养好的菌液,加入 4uL IPTG (200mg /L)和 16 uL X-gal (50 mg /L),混匀后均匀涂布在含氨苄(100mg /L)抗生素的LB平板上,37°C恒温培养箱过夜培养14h,进行蓝白斑筛选。 1.4 PCR检测克隆载体 从平板上随机挑选分隔良好的白色菌落,置于含氨苄(l00mg r)抗生素的LB液体培养基中,37°C, 165 r/min摇菌12·14 h,用质粒微量提取试剂盒提取质粒,对质粒用取Bgl //和Bst EⅡ酶切进行鉴定,片段符合预期,证明目的片段己经连接到了载体上,得到重组质粒LFY-T。 1.5 克隆LFY测序 质粒送样测序,将测序结果与Genebank上登录的拟南芥因序列比对,发现核苷酸序列有三个碱基不同,但氨基酸序列完全一致(图3-2),说明该获得的基因全长序列可以用于表达载体的构建。 2. CAMV 35S启动的基因植物表达载体构建 CAMV 35S组成型启动子和拟南芥基因融合表达载体构建如下:将LFY基因片段、pCAMBIA1301分别经Bgl //和Bst EⅡ酶切处理,酶切后片段回收连接植物表达载体pCAMBIA1301相应位点并对重组质粒进行Bgl //和Bst EⅡ酶切鉴定片段都与预期的大小符合,证明目的片段己经连接到了载体上,得到植物表达载体35S::LFY。 2.1 表达载体图谱介绍 35S启动子启动的基因过量表达载体p35S: :LFY(如图3-3) 2.2 表达载体导入根癌农杆菌 将因过量表达载体p35S: :LFY经冻融法转化农杆菌EHA105后,挑取单克隆,摇菌获得转化农杆菌菌 液,每瓶菌液中取lul,经菌液PCR检测证明LFY基因过量表达载体p35S: :LFY已成功导入根癌农杆菌EHA105。 2.3 转化农杆菌的筛选 CaMV35S启动的LFY基因过量表达载体是潮霉素抗性的,所以在转化前需要对所转的百合品种先进行抗性浓度的筛选,确定合适的筛选浓度,以MS+6-BA2. 0mg /L+NAA0.2 mg/L为基本培养基,潮霉素浓度使用了 0, 20,25, 30, 40,50,60,70,80,90mg /L。本实验重复三次。 2.4 转化农杆菌的筛选结果 在添加不同浓度潮霉素的培养基上培养2个月后,观察统计结果,结果表明:随着潮霉素浓度的增加外植体的成活率逐渐降低,当潮霉素浓度为20 mg /L时,鳞片全部褐死,故潮霉素筛选浓度确定为20 mg/L(表4-1)。  表达载体转化百合3.1 预培养 以亚洲百合‘精粹’培养三个月的初代无菌苗小鳞片为材料,用