病毒检测教案分析.ppt

4.捕获法（反向间接法）：HAV-IgM、HBc-IgM TPPA的结果判定 胶体金免疫层析试纸条的构成 GICA反应模式 A 双抗体夹心法测抗原 B.竞争法测抗原 C.间接法测抗体（反流免疫层析法） 胶体金免疫层析技术应用 类别 应用领域 检测物质 人类医学 各级医院、血站、CDC、防疫站、诊断中心，家庭自检、商检系统，边检口岸，公安系统 传染病（乙肝五项，HIV，SARS等） 标志物（AFP，肌钙蛋白，粪便血红蛋白等） 女性妊娠HCG（早孕） 毒品（吗啡，K粉，摇头丸，冰毒） 农牧业 畜牧兽医站、边检口岸、商检系统、农牧类院系和研究所 传染病（禽流感，链球菌等） 病毒（烟草花叶病毒，犬细小病毒等） 环境 环境监察部门、研究机构 有害物质超标 食品安全 食品安全监管中心，各监管部门 农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等），大肠杆菌，黄曲霉素 病毒抗体（抗原）检测 汇报人：闫璐 酶联免疫吸附测定（ELISA） 胶体金免疫层析技术（GICA） 梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA) ELISA基本原理 ?使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ?使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ?样品和酶结合物与固相载体上抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物，洗涤去除未结合物，加入底物，根据底物显色程度来判定免疫反应是否存在及待测物质含量。 包被、封闭 聚苯乙烯 聚氯乙烯 硝酸纤维素膜 玻璃纤维素膜 尼龙膜 塑料制品 微粒 膜载体 固相载体 合微球或颗粒高分子单体聚 包被：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程称为包被。 封闭：用1%~5%的牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清再包被一次，消除由于加入血清和酶结合物中蛋白质部分吸附于固相载体表面产生非特异性显色的干扰，此过程称为封闭。 牛血清白蛋白 固相载体 包被抗体 ELISA的酶应符合以下要求： 纯度高； 催化反应的转化率高； 专一性强； 性质稳定； 来源丰富； 价格低廉； 制备成酶结合物后仍继续保留活性和催化能力； 在受检标本中不存在相同的酶； 相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定。 乙酰胆碱酯酶 辣根 过氧化物酶HRP 碱性 磷酸酶AP β-D-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 ELISA 常用酶 HRP 来源 组成 主酶 辅基 无色糖蛋白 275nm 亚铁血红素 403nm 酶活性基团 纯度：RZ=A403/A275 ELISA:RZ3.0 酶结合物组成成分 酶 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 抗原和抗体 抗体：特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产、易于分离纯化。常用纯度较高的IgG。 抗原：模式不多，要求纯度高，抗原性完整。 酶结合物的制备 戊二醛交联法： ELISA中常用的酶一般都用此法交联。 一步法：戊二醛直接加入酶与抗体的混合物 1.酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊 二 醛，再与抗体作用而形成酶标抗体。 两步法： 2.抗体与戊二醛作用，再与酶联结。 过碘酸盐氧化法：用于含糖量较高的酶。HRP的标记常用 此法。 方法：过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，与蛋白 质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。 方法 底物选择 未被酶催化以前应该是无色的，而经酶催化后有明显的颜色变化； 所显色易于洗脱； 显色后的产物要求稳定； 价廉，易得而且无毒。 AP：硝基苯磷酸盐，桔黄色， NaOH终止反应403nm测定OD值。 过去： 5-氨基水杨酸 棕色 HRP 1.邻苯二胺（OPD） 桔黄色 H2SO4/柠檬酸 棕黄色 492nm 现在 2.邻联甲苯胺（OT） 蓝色 不需终止 630nm 加终止剂 黄色 405nm 3.3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）蓝色 NaN3/SDS 黄色 450nm ELISA温育常用温度 43