蛋白质及氨基酸分析精要.ppt

第二节 蛋白质的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了常用染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法） 1.原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫 酸被还原成二氧化硫，样品中的有机氮转化为氨与过量 的硫酸结合成硫酸铵; 然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用弱 酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐酸或硫酸溶液滴定，根 据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 2.操作步骤 准确称取样品0.50-2.00g→500ml凯氏瓶中→加10g 无水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20mLH2SO4→通风橱中先以 小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑 粒后（不时转动消化瓶使粘附于瓶壁上的样品溶于消化 液中）→继续消化30分钟→至到样液呈绿色，停止消 化，冷却。 将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。 向接收瓶内加入10mL4%硼酸溶液和1～2滴混合指示 剂。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸入 硼酸溶液中。取10±0.05mL稀释定容后的试液，沿小玻 璃杯移入反应室，并用少量蒸馏水冲洗小玻璃杯，一并 移入反应室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约 10mL40%氢氧化钠溶液。提起玻璃塞，使氢氧化钠溶液缓 慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加 水，使之密封。蒸馏5min。降低接收瓶的位置，使冷凝 管管口离开液面，继续蒸馏1min。用少量蒸馏水冲洗冷 凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。 用0.1mol/L（或0.05mol/L）盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。 同一试样做两次平行试验，同时做空白试验。 蛋白质的含氮量一般为 15%～17.6%，有的上下浮动,可以测出总氮. N/16%=N×6.25=蛋白质含量 各种试剂的作用 （1）硫酸钾：作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 330℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加 入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。 （2）硫酸铜：作为催化剂。还可以作消化终点指示剂 （做蒸馏时碱性指示剂）。硒粉、氧化汞、汞（均有 毒，价格贵）、二氧化钛都为催化剂，但为了防止污染 通常采用硫酸铜。 (3)40%NaOH的作用 影响氨化完全和速度的因素 （1）K氏烧瓶和取样量 如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800～1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。 （2）分解剂 ①?H2SO4和K2SO4的添加量 ?? 有机物分解需要H2SO4量，应根据有机物种类不同而 加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了 提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能 太少，太少则氨化不充分。 K2SO4和H2SO4的添加比例是： 1g样品???? K2SO4：? H2SO4=7g：12mL 这种比例在国内外都使用，是公认的 还有一种比例：?? K2SO4：H2SO4=10g：20mL ② 催化剂 ??? 用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、 TiO2。Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一 种，用TiO2的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间 不同，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。 （3）热源的强度 消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很 大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义 的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低。 说明及注意事项 ①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物未消化完全而造成氮损失。 ③消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。 ④样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 ⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3mL后再继续加热消化。 ⑥若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。 ⑦一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑧蒸