蛋白质组学中的双杂交精要.ppt

蛋白质组学中的双杂交 马萍 2009.4.22 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了功能基因组时代。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，蛋白与蛋白间相互作用几乎调节每个生命过程 。 蛋白间相互作用的意义及应用 结构蛋白的相互作用对细胞形态的维持（纤维蛋白 ） 蛋白质代谢、修饰中的作用 （蛋白质可逆磷酸化 ） 信号转导与识别 （cAMP信号通路 ） 形成复杂的蛋白质复合物 （DNA复制、转录，蛋白质翻译） 筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 整个蛋白质组中蛋白间相互作用的网络图绘制（困难的工作） 应用最广泛、最成功的评价蛋白相互作用的方法是酵母双杂交系统。 概念最初是Stanley Fields提出的，酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识 。利用真核转录因子和酵母（酿酒酵母）强大的遗传学背景来检测蛋白相互作用。 基于酵母双杂交的相互作用组学的研究 其他的酵母双杂交衍生的技术 哺乳动物双杂交系统 酵母双杂交在药物运载的应用 双杂交在相互作用位点图谱绘制的应用 结论和展望 基于酵母双杂交的相互作用组学的研究 随着酵母大规模蛋白质相互作用网络图谱的成功描绘，蛋白质相互作用特别是大规模蛋白质相互作用研究成为生命科学领域的又一个研究热点。酵母、果蝇、线虫以及人类蛋白的大规模相互作用图谱的相继完成，不仅对系统研究细胞内各种生命活动有着重要意义，也标志着蛋白质相互作用研究方法的不断发展和完善。 特殊途径或疾病因素的酵母双杂交筛选系统（深入） 例如：寻找与亨廷顿相互作用的神经退行性变的遗传修饰因子，与几个已知的遗传共济失调相关的蛋白的相互作用子 人类核激素受体和它的辅助因子间的相互作用网络 促进蛋白相互作用的核受体的小分子配体 研究低等动物的特殊途径和功能 大规模的酵母双杂交—有丝分裂纺锤体相关蛋白的功能和与其他细胞活动的联系 限制和挑战 相互作用网络的形成需要耗费大量的人力和物力 （混合共用和重叠合成法 ） 假阳性和假阴性的频繁的发生 假阴性是真正的相互作用但在筛选的过程中没有检测到，由核定位或融合蛋白不正确的折叠引起。 假阳性的主要来源是异源蛋白的过量表达引起的不相干的相互作用和无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（25%-45% ）。 消除：生物信息学系统追踪方法 其他的酵母双杂交衍生的技术 膜酵母双杂交系统 （MYTH） 细胞质酵母双杂交系统 (cytoYTH) 基于泛素分裂的原理 细胞质的诱饵蛋白绑定在Ost4p（一个小的酵母内质网整合膜蛋白），限制了在细胞质中诱饵蛋白和猎物蛋白相互作用。 应用在核环境中很难研究的蛋白 间隔特异性的酵母双杂交 其他例如抑制转活系统的方法和基于RNA-聚合酶III系统的方法 哺乳动物双杂交系统 期望在人类蛋白质相互作用系统中能产生更加可靠和环境特异性的结果 很难大规模的筛选 用于操作哺乳动物细胞系的改进的方法，如慢病毒载体，和用阵列格式平行分析人类细胞的快速进展能考虑到在系统生物学的哺乳动物双杂交系统的未来应用。 蛋白片段隔离的方法被广泛应用到大规模的分析，而且在药物运载和蛋白质工程还有很大的潜能 烟草花叶病毒的断裂（Split-TEV system） 哺乳蛋白相互作用陷阱（MAPPIT系统 ） 酵母双杂交在药物运载的应用 可逆的酵母双杂交系统和酵母三杂交系统，可用来评价生理环境下小分子与蛋白间的相互作用。 在药物运载上的应用至今还被技术困难和已经确定的其他方法所阻碍，技术改进和较好的筛选平台将会有更加广泛的应用。 可逆酵母双杂交（rYTH） 酵母三杂交（Y3H） 双杂交在相互作用位点图谱绘制的应用 随机诱变和可逆酵母双杂交筛选绘制蛋白相互作用位点图谱 主要缺点是大多数的突变会产生截断或关于蛋白相互作用无意义的错误折叠 通过易错PCR对随机诱变最优化和酵母双杂交挑选能更好的描述蛋白相互作用界面中的分子识别 绘制出了DNA甲基转移酶的催化域和它的调节因子作用的界面 结论和展望 酵母单杂交—核酸和文库蛋白之间的研究 酵母三杂交—三种不同蛋白之间的互作研究 酵母反向杂交技术—两种蛋白相互作用的结构和位点 膜酵母双杂交 、细胞质酵母双杂交、哺乳双杂交 蛋白相互作用组学网络、药物载体、筛选新药 联合双杂交筛选程序和高通量DNA分析的应用，如DNA微阵列或新兴的测序技术，能将通过双杂交方法分析相互作用组学提高到一个整体的新的水平。 细菌双杂交与酵母双杂交比较 传统酵母双杂