蛋白表达系统分析.ppt

原核表达载必备的组成 细菌表达系统 酵母表达体系 酵母表达系统 昆虫表达体系 可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰 糖链有所区别，表达量有限 作为药物宿主细胞未被FDA认可 昆虫表达系统（Bac-N-blu体系） 昆虫表达系统（Bac-to-Bac体系） 哺乳动物细胞表达体系 动物乳腺组织表达 用显微注射法产生转基因小鼠 利用转基因羊在乳汁中生产重要的转基因蛋白 表达系统的选择 * * 蛋白表达体系概述 目的基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 表 总体技术路线 基因载体 目的基因 质粒 噬菌体 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文库 限制性内切酶 有切口的载体 有切口的目的基因 DNA连接酶 重组体 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主细胞 表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法 目的基因的表达 ? 表达体系的发展 ? 表达体 载体 宿主 第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌 第二代 酵母表达体系 穿梭质粒 酵母 第三代 哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体 培养细胞 第四代 基因直接导入 DNA本身 生殖细胞、 体细胞、个体 有抗菌素抗性基因 决定载体拷贝数的复制起点 (ori ) 供外源基因插入的多克隆位点 参与控制转录与翻译的必不可少的原件 另注：外源基因在原核寄主细胞中表达 , 它的编码结构必须是连续的 , 不间断的 , 处于寄主启动子有效控制下。 核糖体结合位点 启动子 转录终止子 复制 起点 质粒型表达载体 病毒型表达载体 真核生物细胞常用的表达载体 腺病毒表达载体 逆转录病毒表达载体 昆虫杆状病毒表达载体 特殊的表达用菌株 BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体 M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体 BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase（硫氧还蛋白还原酶）突变 thioredoxin reductase/glutathione reductase （硫氧还蛋白还原酶/谷胱甘肽还原酶）双突变 适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键 BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达 BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达 优点：可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达; 缺点：糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高; 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe） 可进行分泌表达，有天然立体结构 加糖方式与人体蛋白质完全一致 表达量不够高，培养成本较高 分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质 至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产 转基因动物制作花费巨大，实验周期长 *