蛋白电泳与转膜分析.pptVIP

* * * * * 实验5 电泳技术 2014-11-03 5.1 电泳技术分类 5.1.1 电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动的现象。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 5.1.2 电泳技术：1936年瑞典学者蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定的技术。在生命科学研究中电泳技术主要用于蛋白质、核酸、同工酶、氨基酸、多肽等物质的分离和对分离物质的纯度与分子量的测定。 5.1.3 电泳技术的分类： 自由界面电泳：是不含支持物的电泳。溶质在自由溶液中泳动，故也称自由电泳，适用于高分子的检测，但不易完全分离。 区带电泳：是含有支持物的电泳，支持物上混合样品被置于狭小的区带中泳动，分离出彼此分离的区带。支持物有很多种，由此又衍生出区带电泳的不同分支。 在生物技术研究中区带电泳应用最为广泛！ 区带电泳的分类： （1）按支持物的物理性状不同分为： 纸电泳：支持物为滤纸; 粉末电泳：如纤维素粉，淀粉，玻璃粉电泳； 凝胶电泳：淀粉胶，琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶电泳； 缘线电泳：如尼龙丝，人造丝电泳 （2）按支持物的装置形式不同分为： 水平板电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式； 垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。 柱状（管状）电泳：聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳。 凝胶电泳（以蛋白分离为例）： （1）单向电泳：在聚丙烯酰胺凝胶上分离，适于分离种类较少的蛋白。 （2）双向电泳：第一向使用预制胶条进行蛋白质的等电聚焦分离，第二向将胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质的分子量大小与第一向相垂直分离。用于蛋白质的分离，可将提取的蛋白质混合物中数千种蛋白质同时分离开。 5.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.2.1 背景介绍： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳于1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。 5.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理： （1）阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 （2）结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。 （3）这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。 浓缩胶 电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 Gly- Pro- Cl- - + 分离胶 孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使样品很好的分离.当样品进入分离胶,pH,凝胶孔径改变,使慢离子的泳动率变大,超过蛋白,高强度电厂消失.因此蛋白在均一的pH,和电场强度下通过分离胶.如果蛋白质分子量不同,通过分离胶受到的阻力不同，泳动率也不同,因此能够根据蛋白的分子量不同而分开. Pro1- Pro2 Gly- Cl- - + 积层胶 分离胶 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。 凝胶分离范围 凝胶的筛分特性取决于它的