基因功能的研究方法分析.ppt

第十章.基因功能的研究方法（一） 确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度很大的领域。 一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突变鉴定，但实际上还有很多空白。 大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母，所知更少，仅为30%。 一、计算机预测基因功能 计算机预测基因功能的依据仍然是同源性比较。同源基因都有1个共同的祖先基因，他们之间有许多相似的顺序。同源基因可以分为2类： 种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之前的同一祖先。 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因为这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但它们有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸位置是相同的。 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。 根据同源性预测基因时必需注意以下几点： 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上可视为同源基因； 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的80%的相似性不能称为同源性。 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序列中所占的比例，而相似性除一致性aa外还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的比例总是高于一致性aa。 同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息 同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多种，而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要比核苷酸的差异大的多。 以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的是BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会得到回音。 有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出现局部相似的区段。这种情况表明，2个无亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相似的顺序是功能的核心区域。 虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔，在进化中一方面发生独立突变，另一方面又因基因组重排成为新基因的组成部分。例如信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基本的功能域，即接受信号的功能域和传达信号的激酶域。 二、实验确认基因功能 同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将同源性研究的结果进一步外延。 如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难的问题之一。 大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究是远远不够的。 基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系列反应。 传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因； 现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基因相关的表型。 所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。 上述传统遗传学分析的原理同样可用来设计从基因到表型的研究。如果我们能找到某种方法，根据待测基因的顺序使生物体内该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型变异。 1.1 基因敲除（Gene knock-out） 概念：基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 1.2 基因敲除的技术路线如下： 构建重组基因载体； 用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内； 用选择培养基筛选已击中的细胞； 将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。 Note: 基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低，约为百万分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此，同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题。 目前已有多种筛选方法，其中1988年犹它大学的Capecchi教授的研究组发展的正负双向选择系统适用范围宽且效率较高。 建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料 基因敲除小鼠是研究