蛋白质组学总结概要.ppt

§2 肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术 特定的质量，且产生的片段数目亦有特异性，故称指纹谱。 肽质量指纹谱 (peptide mass fingerprinting, PMF)是指蛋白被酶切位点专一的蛋白酶水解后，得到的肽片段质量图谱。由于所产生的肽段具有特定序列、长度，因而具有 为什么要酶切蛋白样品？ 蛋白分子往往有许多的修饰位点，而且这些修饰未必均一，因而，难以通过质量直接确定样品为何种蛋白。 但如果进行酶切后，产生了多条肽段，其中有些肽段是没有修饰位点或未被修饰的，其质量信息，能准确反应肽段的氨基酸构成情况，在数据库中查找、比对时，便可知这类肽段源于何种蛋白，进而确定样品是何种蛋白。这是对蛋白分子进行胶上酶切的重要原因之一。 此外，酶切产生肽段数目固定，是肽质量指纹图谱的重要信息；18O从头标记也需要对蛋白分子进行酶切。 常用酶类 要 求： 水解为点专一； 切出的肽段适合质谱分析（约几千Da），利于检索； 酶自身稳定，不易降解。 常用酶类： 胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶等。 §3 液相色谱—电喷雾—串联质谱 一、电喷雾电离源的工作原理 利用高压电场使进样端的毛细管流出的液滴带电，在N2气流作用下： 液滴溶剂蒸发——表面积减小——表面电荷密度不断增加——库伦斥力与表面张力达到雷利极限——液滴爆裂为带电的子液滴； 这一过程不断重复，最终液滴非常细小，称喷雾状，表面电场强大，使分析物离子化，以带单电荷或多电荷离子形式进入质量分析器。 电喷雾电离产生多电荷离子： 可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将质谱仪的质量范围放大的n倍。 多电荷离子的有关计算： 对于蛋白质，产生的多电荷离子为：[M+nH]n+ 系列离子。 假设某一质谱峰 (m/z)1 对应的离子为[M+nH]n+, 另一相邻质谱峰(m/z)2 对应的离子为[M+(n+1)H](n+1)+, 且两个峰均为同一蛋白质产生，则可通过建设联立方程组来得到M和n的具体数值: 解方程组得到 M 和 n。 可以编制程序将所有相关的峰进行计算并取平均值，则可得到较精确的分子量信息。这一过程称作解卷积(Deconvolution)。 二、液相色谱—电喷雾—串联质谱 ( LC-ESI-MS/MS ) ESI后连接串联质谱，可检测离子结构碎片和质荷比，提供离子结构（比如序列）的信息，应用于核酸、多肽及蛋白的鉴定和翻译后修饰的分析。 串联质谱仪 离子源 多级质量分析器 碰撞室 一级质量分析器 总离子 母离子 碰撞室 二级质量分析器 子离子 产生 分析核质比 母离子经高速惰性气体碰撞诱导解离，产生碎片离子/子离子 三级四极杆质量分析器是怎样测定多肽序列的？ 由三个顺序连接的四极杆构成，第一、三个四级杆分别用于母离子和子离子选择，第二个充当碰撞室。 由电喷雾离子源生成的总离子经过第一个四极杆（一级质量分析器），筛选出特定离子——母离子——进入后续检测；母离子进入第二个四极杆（碰撞室），经高速惰性气体碰撞诱导解离，产生碎片离子（子离子）；子离子由第三个四极杆（二级质量分析器）分析其质荷比。 最后，根据母离子产生的各种子离子的质荷比计算出子离子的质量，根据断裂处相邻的子离子的质量差，确定氨基酸残基，进而推算出氨基酸序列。 小肽断裂碎片离子定义 b y 四 肽 a、b、c 型离子保留肽链 N 端，电荷留在离子 C 端 x、y、z 型离子保留肽链 C 端，电荷留在离子 N 端 二、 18O 标记从头测序技术 肽段的断裂主要形成b或y型离子，但判断受样品纯度、溶液中盐分因素制约，有时不易读出。同时为保证能够只读出含有肽段原始末端的y型离子，解决办法—— 蛋白质在酶解时，酶解液中H218O和H216O各占50%，这样酶解后肽段的羧基端上的羟基氧的18O/16O同位素丰度比为1：1，使得y型离子系列的M+2/M的同位素峰的丰度比远高于正常未标记18O离子的同位素峰的丰度比，从而比较容易地分辩出y系列离子，用这种方法可以较准确地读出10个以上的氨基酸序列。 四极滤质器（Quadrupole Mass Filter） 四极滤质器（四极杆）由四根平行金属杆组成，理想的四杆为双曲线，但常用的是四支圆柱形金属杆，被加速的离子束穿过对准四根极杆之间空间的准直小孔。 在四极杆上加上直流电压U和射频电压V，在电场力的作用下，只有m／z合适的离子才会通