流式细胞术概要.ppt

流式细胞术Flow cytometry，FCM 1. 流式细胞仪(Flow Cytometer):是现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备。 2. 流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。 四、流式细胞术的样本设置 1. 常用对照 阴性对照 阳性对照 空白对照 补偿对照 2.一套完整的流式细胞术检测样本设置 阴性对照 作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，即确定待测标本的基础荧光域值 免疫球蛋白同型对照（同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白。反映待测标本对抗体非特异性结合的 水平） 阴性细胞对照（用已知不表达某种抗原的细胞进行平行实验，通常用于确定抗体的特异性） 阳性对照 即用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）细胞进行平行实验，通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。 空白对照 即不进行标记的细胞。有些细胞内物质会同样被激发而产生自发荧光。空白对照的主要作用用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。 补偿对照 由于光谱的重叠，对于多色分析样本必须设置补偿对照。补偿对照主要用于多色分析时荧光光谱重叠的补偿调节。 补偿对照是将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本反应，一一进行单色标记，以测定荧光信号的重叠并作适当调节。 2.一套完整的流式细胞术检测样本设置 流式细胞术的基本原理是利用细胞标记前后的荧光强度改变来确定细胞性状，故一套完整流式样本即要有用于确定其基础荧光域值的对照（如空白对照或阴性对照），又要有已标记的待测样本。一套完整的流式样本设置可根据其不同的标记方法进行如下设置。 直接标记样本 对于单色样本应设置空白对照、阴性对照（同型抗体对照）和待测样本。对于直接标记多色样本，在单色基础上另加补偿对照。 间接标记样本 对于单色样本应设置空白对照、阴性对照（一抗同型抗体对照）和待测样本。 对于多色样本，在单色基础上另加补偿对照，一般不建议使用。 三、流式细胞术基本原理 1.流式细胞术分析的基本原理 2.流式细胞术分选的基本原理 3.流式细胞仪荧光补偿设置 1.流式细胞术分析的基本原理 前向散射与侧向散射是细胞的固有属性，暂称为物理属性。 荧光信号是人们通过不同手段将荧光物质结合在细胞上，是人为属性，暂称为化学属性。 R1：淋巴细胞 R2：单核细胞 R3：粒细胞 R4：红细胞裂解碎片和少量血小板 2.流式细胞术分选的基本原理 3.流式细胞仪荧光补偿设置 以FITC、PE双色分析为例： （1）先调节阴性对照管（即同型对照IgGFITC、IgGPE）：先将原补偿清零，通过调节电压，使阴性群落在FITC和PE双阴性区。阴性对照的作用是，调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。 （2）FITC标记抗体/IgGPE：(IgGPE为同型对照) 此时电压已通过阴性对照设定，绝不能变动。当PE探测器检测到的FITC信号恰好完全消除时，补偿便是正确的，即FITC单阳性细胞的PE信号与阴性对照的PE信号一致。 注：首先要知道双阴性细胞的情况，其次是在检测管中，必须要有FITC单阳性细胞和双阴性细胞。 （3）IgGFITC/PE标记抗体：同理，将进入FITC探测器的PE信号降至本底一致，前提是必须有PE单阳性细胞和双阴性细胞。 （4）当设置好以上补偿条件后，即补偿调节完毕。 （5）进行多色分析时，必须做各荧光间的补偿。方法同上，先准备各种标记的荧光阴性对照，确定合适的电压，并逐一调节各荧光标记抗体，与其他荧光对照，然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。 二、流式细胞术的重要术语 1.前向散射与侧向散射 2. Coulter效应与电子体积 3.荧光信号及其面积与宽度 4.光谱重叠与荧光补偿 5.细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间 1.前向散射与侧向散射 2.Coulter效应与电子体积 Coulter效应原理：微小粒子并不导电，但通过充满电解液的小孔时可产生电阻变化，细胞体积越大，电阻的改变越大。可将电阻变化记录为电位变化，用于微小粒子体积测量和计数上。采用这种方法计算该颗粒的体积就是电子体积。 3.荧光信号及其面积与宽度 荧光信号被光电倍增管收集，形成信号脉冲，每个信号脉冲都有其高度、面积与宽度。每种颜色的荧光占用一个特定的检测器，每种颜色的检测器称为一个荧光通道。 脉冲高度表示荧光信号的强度，表示为FLn-Height，n为仪器的荧光收集器序数。 脉冲面积（FLn-A）是采用积分